Laboratorně lze stanovovat koncentraci proteinu imunologickými technikami nebo enzymovou, katalytickou koncentraci pomocí specifických substrátů. Při stanovení jak hmotnostní, tak katalytické koncentrace enzymu je nutno zvažovat přítomnost inhibitorů v séru a vznik makroforem enzymů. Běžně používané stanovení aktivity a-amylázy je založeno na štěpení chromogenního substrátu. Starší postupy, které používaly deriváty přirozeného substrátu-škrobu, byly obtížně standardizovatelné a již se nepoužívají. Současné syntetické substráty jsou odvozeny od maltózy, jako chromogen je nejčastěji používán 4-nitrofenylfosfát. Stanovení isoenzymů a-amylázy je umožněno inhibicí jednoho z obou isoenzymů specifickou monoklonální protilátkou.

Zvýšená hladina celkové aktivity a-amylázy je prokazatelná u celé řady onemocnění. Nejčastějším diagnostickým důvodem je dg. akutní pankreatitidy. Hladina celkové a-amylázy je sice zvýšena ve 100% onemocnění akutní pankreatitidou, zvýšena je však i v 80% všech případů akutních bolestí břicha. Podstatně větší diagnostický přínos má stanovení pankreatického izoenzymu (P-amylázy), jehož hladina je rovněž zvýšena ve 100% případů akutní pankreatitidy, u akutních bolestí břicha je zvýšena jen v 10%. V běžné klinické praxi se používá kriteria 5-násobného zvýšení celkové amylázy, které je dg.indikátorem akutní pankreatitidy. Zvýšená sérová hladina je samozřejmě prokazatelná u akutních i chronických onemocnění ledvin, u střevních zánětů ve 30% případů akutní apendicitidy. Zvýšení hladiny a-amylázy v moči u akutní pankreatitidy přetrvává déle a nastupuje později, než zvýšení hladiny v séru. Slinný typ a-amylázy (S-amyláza) je zvýšen u onemocnění slinných žlaz, u některých plicních chorob, u řady maligních tumorů, ovariální cysty, mimoděložního těhotenství. Normální hodnoty poměru clearance amylázy a kreatininu jsou mezi 2-4%, při pankreatitidě stoupá index na 10%. Zvýšený index clearance amylázy-kreatininu byl prokázán např. u diabetické ketoacidózy, popáleninách, myelomu a u ledvinných poruch. Snížení indexu clearance je diagnosticky významné pro makroamylázemii.

Průkaz makroamylázového komplexu v séru.
Makroamyláza a je příčinou 8-12% případů hypermylázemie (zvýšené hodnoty celkové sérové hladiny a-amylázy). Příčinou je makrokomplex enzymu s vysokomolekulárními proteiny séra, především s imunoglobulíny IgA a IgG. Obdobný makrokomplex tvoří i další enzymy a to např. i pankreatická lipáza. Makroformu a-amylázy lze stanovit gelovou filtrací, elektroforeticky, precipitací s PEG nebo ELISA technikou. Kvantitativní stanovení poměru makroformy enzymu je nejpřesnější s použitím gelové chromatografie na Sephadexu G-100. Separace probíhá v chlazeném boxu při 10 oC na koloně 9 x 150mm při průtoku 3 ml/hod 5 hodin. Aktivita a-amylázy je v jednotlivých frakcích stanovena enzymaticky standardním postupem s pNP blokovaným maltoheptaosidem a výsledkem je poměr obou forem enzymu. Důležitým aspektem pro průkaz makroamylázového komplexu je nestabilita komplexu s immunoglobuliny. Při zmražení a rozmražení séra dochází k disociaci komplexů, makroamylázu je proto nutné prokazovat v čerstvě odebraném vzorku séra. Referenční hodnoty: Makroforma enzymu není za fyziologických podmínek přítomna. Výsledek testu je udáván v procentuálním poměru makroformy amylázy vypočtené z aktivit jednotlivých frakcí. Pozitivní výsledek, průkaz komplexu, je tedy hodnota > 0.

Stanovení pankreatické amylázy ve stolici.
Relativně málo používaný test, který je rovněž imunochemickým průkazem s protilátkou k lidské pankreatické amyláze - novinka, která se objevila v roce 2000. Normální hodnoty jsou nad 360 µg/g stolice, kalibrační standardy jsou v rozmezí 0 -12000 µg/g. Test je založen na ILMA (ImmunoLuminoMetric Assay) principu s luminiscenčním měřením, markerem je akridinium ester.

Lipáza
Lipáza (triacylglycerol acyl hydroláza EC 3.1.1.3.) je rovněž glykoproteinem se 420 449 aminokyselinovými zbytky a molekulovou hmotností 46000 56000 u pankreatické lipázy a 32000 - 39000 u sérové lipázy. Lipáza je hydrolytickým enzymem štěpícím triacylglyceroly s mastnými kyselinami o delším řetězci než 12C, v přítomnosti žlučových kyselin štěpí tuk na monoacylglyceroly a diacylglyceroly. Predilekčně jsou štěpeny mastné kyseliny v polohách 1 a 3. Tak jako a-amyláza je i lipáza produkována žlázovými buňkami pankreatu a secernována do střevního lumen v pankreatické šťávě. Koncentrační gradient mezi pankreatickou tkání a sérovou lipázou je cca 20000:1. Pro enzymovou hydrolýzu je nezbytný serin v řetězci Asp His Ser, pH optimum je mezi 7.5 a 10.0, v závislosti na podmínkách reakce; pl hodnota popsaných forem enzymu je v rozmezí 5.80 a 7.4. Kromě pankreatické lipázy existují další formy triacylglycerolové lipázy např.lipáza jaterní, kterou lze odlišit inaktivcí atoxylem (pankreatická lipáza je rezistentní).

Stanovení aktivity lipázy zahrnuje různé postupy - enzymové štěpení přirozeného substrátu, chromogenních a fluorogenních substrátů a metody imunologické (ELISA, latex-aglutinační). Nejčastěji se používá nefelometrických a turbidimetrických postupů postupů založených na štěpení přirozeného substrátu triacylglycerolu, většina souprav pro enzymové stanovení lipázy obsahuje i ko-lipázu. Turbidimetrické stanovení aktivity lipázy je založeno na vyčeření olejové emulse působením lipolytické aktivity. Tento proces však může být ovlivněn i dalšími složkami séra např. tzv. vyčeřovacím faktorem - pseudolipázou. Nejčastěji se jedná o cirkulující imunokomplexy typu IgM. Pro diferenciální stanovení sérové pankreatické lipázy vedle pseudolipázy s použitím standardního turbidimetrického postupu je vypracován postup založený na inaktivaci pseudoplipázy ß merkaptoetanolem, který vede k disociaci IgM komplexů. Novější chromogenní testy jsou založeny na enzymové kaskádě lipázy štěpící 1,2-diacylglycerol, glycerol-kináze, glycerol-3-fosfátoxidáze a peroxidáze s chromogenním produktem. Zcela nový typ techniky stanovení pankreatické lipázy je založen na změně vodivosti roztoku uvolněním mastných kyselin ze substrátu-trioleinu; detekována je akustickým snímačem a měřenou veličinou je frekvenční odpověď.

Stanovení lipázy je diagnosticky využíváno podstatně méně než stanovení a-amylázy. Důvodem jsou především technické problémy, které stanovení lipázy donedávna přinášelo. Z těchto důvodů vznikla celá řada velmi odlišných metodik k stanovení lipázy, jejichž výsledky lze velmi obtížně vzájemně porovnávat a standardizovat např. referenční meze. Diagnostický přínos stanovení sérové hladiny pankreatické lipázy je však podstatně vyšší než stanovení a-amylázy. Hladina lipázy v séru zůstává po atace akutní pankreatitidy zvýšena podstatně déle než hladina amylázy (popsána je zvýšená aktivita lipázy po 14 dnech). Vzhledem k tomu, že lipáza v séru má svůj původ především v buňkách pankreatu, poskytuje její stanovení podstatně vyšší specificitu, srovatelnou se specificitou pankreatického isoenzymu a-amylázy. V moči je lipáza běžnými posupy nedetegovatelná a nestanovuje se, makroforma existuje u lipázy také, diagnosticky se však opět toto stanovení nepoužívá. Vzhledem k vysoké specificitě je pro praxi, především v oblasti akutní medicíny, navržen imunologický průkaz lipázy jednoduchým latexovým testem.

Makrolipáza (makroforma enzymu) byla prokázána u 2 ze 20 pankreatitid se zvýšenou hodnotou lipázy a tvořila 10-18% celkové aktivity. Poprvé byla popsána v roce 1987 u non-Hodgkin lymfomu, kdy katalytická aktivita lipázy byla zvýšena v séru 7x.

Trypsin
Trypsin (ve formě trypsinogenu) je obdobně jako další pankreatické enzymy produkován acinózními buňkami pankreatu a cestou pankreatického vývodu je secernován do duodena. Část přechází do krevního oběhu, kde jej lze stanovit imunologickými metodami (RIA). Většinou je stanoven trypsin spolu s trypsinogenem a komplexem trypsinu s a₁-proteinázovým inhibitorem (a₁-antitrypsin), v závislosti na použité detekční metodice (specificita protilátek). Fyziologické hodnoty se pohybují v rozmezí 100-400 µg/l opět v závislosti na typu použité detekční soupravy. U akutní pankreatitidy prokazujeme několikanásobné zvýšení (až 20000 µg/l), lehké zvýšení je u cholelitiázy. Snížené hodnoty svědčí pro chronickou pankreatitidu, mukoviscidózu. U karcinomu pankreatu lze prokázat snížené i zvýšené hodnotu trypsinu.

Trypsin aktivační peptid (TAP), který vzniká při konverzi trypsinogenu na aktivní trypsin lze detekovat v moči a zvýšená koncentrace TAP v moči je klinicky signifikantní pro posouzení závažnosti akutní pankreatitidy. Hodnoty TAP v moči nad 15 nmol/l detekují středně těžkou pankreatitidu, hodnoty nad 40 nmol/l těžkou formu onemocnění.

Elastáza-1v séru
Elastáza (EC 3.4.21.11) je secernována jako proelastáza a aktivována trypsinem. Rozlišujeme elastázu-1 (Mr 30000; anodická frakce), která se vyskytuje v séru ve volné formě a v komplexu s a₁-proteinázovým inhibitorem, a elastázu-2 (Mr 25000; katodická frakce). Enzym je secernován pankreatickou šťávou do duodena a během střevní pasáže není degradována proteinová sekvence zvolená pro immunochemickou detekci. Při zánětlivých procesech dochází také k retrográdnímu uvolnění do krevního oběhu a kvantifikace sérové hladiny lidské pankreatické elastázy je vhodným markerem akutní pankreatitidy a karcinomu pankreatu. Hladina elastázy-1 je zvýšena u akutní i chronické recidivující pankreatitidy, přičemž zvýšení přetrvává déle a lépe koreluje s klinickým stavem než hladina a-amylázy. Ke stanovení elastázy-1 se používá RIA metody se ¹²⁵I-značenou elastázou nebo novějších ELISA technik s monoklonální protilátkou k elastáze-1. Nejnovější studie prokazují význam stanovení elastázy-1 v diferenciální diagnostice karcinomu pankreatu. Elastáza-1 (stanovená ELISA technikou) má ze všech pankreatických enzymů pro karcinom pankreatu nejvyšší specificitu i sensitivitu. Referenční rozmezí (pro RIA metodiku) je 1.3-4.3 µg/l.

Tumorové markery v gastroenterologii
Tumorové markery představují značně heterogenní skupinu, do které patří onkofetální antigeny, specifické nádorové proteiny, proliferační proteiny, hormony, enzymy resp. isoenzymy a reaktanty akutní fáze. Stanovení tumorových markerů pro časnou diagnostiku nádorových onemocnění se v gastrointestinální oblasti neosvědčilo. Indikací vyšetření je především monitorování úspěšnosti terapie a dlouhodobé sledování nemocných, kdy změny hladiny tumorových markerů mohou signalizovat rozvoj metastatického procesu nebo recidivu tumoru. Pro přesnější vyhodnocení těchto změn lze s výhodou využít moderních expertních systémů, které pracují na základě statistických a predikčních algoritmů. Ze široké nabídky tumorových markerů lze pro uvedené indikace využít tyto tumorové markery:

Karcinoembryonální antigen (CEA), a₁-fetoprotein (AFP), kyselý a₁-glykoprotein, pankreatickou elastázu-1, sacharidové antigeny CA 19-9, CA 50, CA 72-4 a CA 242. Z hlediska orgánové lokalizace má pro karcinom žaludku nejvyšší pozitivitu CA 72-4, pro kolorektální karcinom CEA a CA 242, a pro karcinom pankreatu CA 19-9 a CA 242. Stanovení více tumorových markerů paralelně zvyšuje specificitu vyšetření, snižuje však jeho senzitivitu.

Gastrin
Gastrin je hormon polypeptidového charakteru (molekula je tvořena 17 aminokyselinami, Mr = 2100), který se vyskytuje ve třech formách. Základní molekula G-17 (little gastrin), G-34 (big gastrin) a G-13 (mini gastrin) zkrácený řetězec na 13 aminokyselin. Pentapeptid s C-terminální sekvencí gastrinu (ß-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2) - pentagastrin se používá ke stimulaci při vyšetření žaludeční acidity.

     Hladinu gastrinu v séru stanovujeme většinou RIA metodou, existují i ELISA varianty imunochemického průkazu. Normální hodnoty 25-100 ng/l jsou výrazně zvýšeny především u Zollinger-Ellisonova syndromu (gastrinom, tumor pankreatu s nadprodukcí gastrinu), kdy prokazujeme 10-1000 násobné zvýšení hladiny gastrinu, která však výrazně kolísá i v průběhu dne; u 20-40% lze zachytit i normální hladinu gastrinu. Vzhledem k existenci tří forem gastrinu závisí výsledek stanovení na typu protilátky použité v testu. Metody stanovení gastrinu jsou standardizovány na syntetický gastrin G-17, stanovení forem G-34 a G-13 závisí na zkřížené reaktivitě s příslušnou protilátkou. Normální poměr forem G-13:G-17:G-34 je 8:2:1, na lačno je vyšší zastoupení formy G-34, po jídle forem G-17 a G-13.
Stanovení gastrinu je součástí gastrinového stimulačního testu, kdy stanovujeme 90ti minutový profil (v 9 vzorcích séra) po stimulaci insulinem, sekretinem nebo Ca-glukonátem. Stanovení hladiny gastrinu-17, pepsinogenu-I a protilátek k Helicobacter pylori třídy IgG nabízí tzv. GastroPanel, který je ne-invazivním, laboratorním parametrem k posouzení infekce Helicobacter pylori, atrofické gastritidy a rizika karcinomu žaludku.

Pepsin, pepsinogen
Pepsin resp. pepsinogen je obecné označení pro řadu proteináz (pepsin A,B,C - EC 3.4.23.1,2,3) a jejich prekurzory (proenzymy). Aktivace pepsinogenu A na pepsin A probíhá v kyselém prostředí, vznikající pepsin A je schopen další aktivace pepsinogenu a vede k tzv. autokatalýze. Elektroforeticky lze separovat v agarovém gelu 8 proteáz žaludeční sliznice, pepsinogeny PG1 - PG5 tvoří skupinu imunologicky identických proteinů - pepsinogen I (PG-I, PGA), pepsinogeny PG6 a PG7 tvoří skupinu pepsinogenu II (PG-II, PGC), posledním proteinem je katepsin E (SMP, Slow Moving Proteinase). Molekulová hmotnost pepsinogenu I je 42 500. Klinický význam má stanovení pepsinu při insulinovém testu a sérová hladina pepsinogenů A a C. Ke stanovení se používá RIA metodik s ¹²⁵I-pepsinogenem v kompetitivním uspořádání. Pepsinogen A je markerem slizniční atrofie a je používán v genetických studiích jako subklinický marker vředové choroby duodena. Pepsinogen C je používán jako marker stavu žaludeční sliznice (případně v poměru PG-A/PG-C) a rovněž jako marker eradikace infekce Helicobacter pylori. Snížení hladiny pepsinogenu A prokazujeme u nemocných s achlorhydrií např. u perniciózní anémie. Nejnovější studie prokazují významné snížení pepsinogenu-I a současně zvýšení hladiny IgA protilátek k Helicobacter pylori u karcinomu žaludku, další studie doporučují stanovení poměru PG-I : PG-II.

Stanovení žaludeční sekrece, acidity
Parietální buňky žaludeční sliznice produkují kyselinu chlorovodíkovou o koncentraci cca 0.5 mmol/l). Zdrojem vodíkového iontu H⁺ je voda,která je disociována membránovou hydrolýzou v součinnosti s reakcí karboanhydrázy produkující CO₂. Karboanhydráza je limitujícím faktorem tvorby HCl v žaludeční sliznici. Regulace žaludeční sekrece je řízena neurohumorálně, významným faktorem je hladina gastrinu. Vyšetřování žaludeční acidity je založeno na stimulaci parietálních buněk, odběru žaludeční šťávy a stanovení obsahu volné a celkové HCl. Ke stimulaci je nejvhodnější pentagastrin, použít lze i histaminu (Lamblingův test) nebo insulinu. Hodnocení funkčního testu je však závislé na typu stimulace tj. výsledek se liší po podání gastrinu, histaminu nebo insulinu.

Provedení testu. Pacient přichází na lačno a je mu zavedena žaludeční sonda, jejíž pozici je nutno ověřit skiaskopií. Pomocí odsávačky je odčerpáván žaludeční obsah a jednotlivé porce jsou sbírány po 15 minutách, celkem 2 hodiny. Nejprve je odebrána veškerá žaludeční šťáva na lačno - porce T₀ a pak následuje sběr nestimulované, basální sekrece T₆₀ 4 x 15 minut. Po 1 hodině testu je provedena stimulace 6 µg pentagastrinu/kg váhy subkutánně (histamin podáváme jako 1% roztok v dávce 0.1 ml/10kg váhy, insulin podáváme i.v. 10-20 IU NI). Následuje odběr dalších 4 porcí po 15 minutách - stimulovaná sekrece T₁₂₀.

Laboratorní analýza žaludečního obsahu a stanovení koncentrace HCl. Ve všech porcích změříme pH, objem porce a titračně stanovíme koncentraci HCl. Titrujeme 10 ml (minimálně 5 ml) žaludeční šťávy pomocí 0.1 mol/l NaOH v přítomnosti barevného pH-indikátoru (např. diethylaminoazobenzen). V každé frakci stanovujeme koncentraci HCl, vypočítáme celkový výdej HCl a sekreční rychlost mmol HCl/hodinu. Indexy používané v diagnostice jsou označeny BAO (Basal acid output), stanoven z basální frakce T₆₀ před stimulací; PAO (Peak acid output) stanovený průměrem ze dvou frakcí s nejvyšší koncentrací HCl a MAO (Maximum acid output) jako výsledek hodinové stimulované sekrece T₁₂₀. Při insulinovém testu se stanovuje i koncentrace pepsinu jako BPO (Basal pepsin output) a MPO (Maximal pepsin output).

Referenční hodnoty testu s pentagastrinem: BAO 1-5 mmol HCl/hod, MAO 10-23 mmol HCl/hod, PAO 8-40 mmol HCl/hod. Hodnoty u mužů jsou vyšší než u žen (PAO u mužů je 11-40, u žen 8-33 mmol HCl/hod). Po stimulaci histaminem hodnotíme celkový objem žaludeční štávy, normální hodnoty jsou 150-250 ml/2 hod a celková acidita 72-80 mmol HCl/l. Hodnoty insulinového testu jsou u mužů BPO 32 ± 29 mg/hod, MPO 320±170 mg/hod; u žen BPO 60±81 mg/hod, MPO 170 ± 150 mg/hod.

Hypochlorhydrie (hypoacidita) až achlorhydrie (anacidita) je signifikantním příznakem perniciózní anemie, podezření na malignity (karcinom žaludku vykazuje však v časných stádiích hyperaciditu i normoaciditu). Dg.významné je stanovení žaludeční acidity při Zollinger-Ellisonově syndromu, kdy prokazujeme vysokou bazální i maximální sekreci (BAO>15, MAO>60), ve více než 50% případů Zollinger-Ellisonova syndromu je index BAO/MAO > 0.60.

Dechový test s 13C-octanoátem sodným (OABT)
V diferenciální diagnostice funkčních dyspepsií, refluxních onemocnění i pro indikaci některých moderních léků (prokinetika) lze použít měření rychlosti vyprazdňování žaludku, motility, ne-invasivním, ne-radioaktivním dechovým testem. Pacient je zatížen 100mg 13C-octanoátu sodného a pak jsou odebírány 4 hodiny vzorky vydechovaného vzduchu v 15 minutových intervalech. Vyhodnocení kinetiky procesu měřením změny poměru 13CO2 : 12CO2 lze provádět technikou IRMS nebo IR analyzátorů.

Sekretinový přímý funkční test
Vyšetření exokrinní funkce pankreatu je zaměřeno ke stanovení pankreatické insuficience. Jako tzv. "zlatý standard" je označováno vyšetření přímé, kdy provádíme analýzu duodenálního obsahu po stimulaci enterohormóny. Jedná se o test, jehož výsledky poskytují jednoznačně nejvyšší specificitu i sensitivitu, test je však invasivní, náročný pro nemocného a vyžaduje náročnou laboratorní analýzu duodenálního obsahu.

Na stimulaci pankreatu se podílejí dva hormony, sekretin a cholecystokinin. Sekretin stimuluje vlastní sekreci pankreatické šťávy a produkci hydrogenuhličitanu, cholecystokinin stimuluje sekreci trávicích enzymů. Sekretinový test proto umožňuje zhodnocení pouze objemu pankreatického sekretu a koncentraci hydrogenuhličitanu, ke zhodnocení sekrece trávicích enzymů je nutné použít kombinované stimulace tj. sekretin-cholecystokininový test (PZS test; cholecystokinin = pankreozymin). Ke stimulaci může být použito místo cholecystokininu i ceruleinu. Sekretin-CCK test je prováděn v mnoha modifikacích, které se liší jak v množství stimulačních hormonů, ve formě podání (i.v., v infúzi), podání vnitřního markeru pro korekci objemu i ve způsobu analýzy duodenální šťávy.

Provedení testu. Pacient přichází nalačno a je odebrán vzorek séra. Pod RTG kontrolou je zavedena nejprve žaludeční sonda (slouží k odčerpávání žaludečního šťávy a zamezení kontaminace duodenálního obsahu) a poté druhá sonda do duodena. Přítomnost žluče v aspirátu a alkalické pH je rovněž kontrolou správného zavedení. Po odčerpání 1.frakce (lačný vzorek pro stanovení basálních hodnot) je podána i.v. stimulace cholecystokininem (nejčastěji 1 IU/kg váhy i.v.) a je proveden odběr duodenální šťávy - 20 minut. Následuje stimulace sekretinem (nejčastěji se podává 1 IU/kg váhy) a odčerpání dalších 3 frakcí po 20 minutách. Laboratorní zpracování zahrnuje změření objemu, stanovení pH, podle barevné škály zhodnocení tzv. ikterického indexu, stanovení koncentrace HCO₃^-, a aktivity pankreatických enzymů a-amylázy, lipázy a trypsinu běžnými enzymovými metodami.

Sekretin-CCK test poskytuje ze všech dostupných testů nejpřesnější informace o sekrečních poměrech pankreatu. Přes nestandardnost jeho uspořádání je považován za "zlatý standard" funkčních testů pankreatu ke zhodnocení především pankreatické insuficience. Normální hodnoty závisí na způsobu stimulace, odběru i analýze duodenálního obsahu. Uvedené hodnoty jsou jednou z variant. Objem sekrece stimulované sekretinem 165-536 ml/hod, koncentrace HCO₃^- 9.8-39.7 mmol/hod, aktivita trypsinu 9.3-171 j/20 minut, aktivita amylázy 34-204 j/20 minut.

Nepřímé funkční testy
Nepřímé funkční testy jsou založeny na principu, kdy perorálně je podán chromogenní (nebo fluorogenní) substrát, který je štěpen pankreatickými enzymy (chymotrypsinem, lipázou). NBT-PABA test (Bentiromid, Roche; není již vyráběn) obsahoval substrát N-benzoyl-L-tyrosyl-4-aminobenzoovou kyselinu (Bz-Tyr-PAB), u nás byl vyráběn ALTAB test (Spofa-Gnost Pankenzan, Léčiva) se susbtrátem N-acetyl-L-tyrosyl-4-aminobenzoovou kyselinou (Ac-Tyr-PAB), který poskytoval lepší diskriminaci mezi souborem nemocných s insuficiencí pankreatu a kontrolním souborem. Fluorogenní variantou je preparát Pankreolauryl (substrátem je fluorescein-di-laurylester). Koncentrace chromogenu (fluorogenu) vyloučeného močí, resp. jeho koncentrace v séru je mírou aktivity enzymu v duodenu. Mezi nepřímé testy patří i stanovení chymotrypsinu nebo elastázy-1 ve stolici. V poslední době se objevují další nové funkční testy - dechové testy, kdy perorálně podaný substrát je značen izotopem uhlíku ¹³C (starší testy izotopem ¹⁴C). Mírou aktivity pankreatických enzymů je koncentrace ¹³C (nebo ¹⁴C) ve vydechovaném vzduchu.

Pacient přichází nalačno a je odebrán vzorek séra a moče. Následuje podání substrátu (Ac-Tyr-PAB ve 4 tabletách) a stimulační pokrm (modifikace Lundhovy snídaně - hydrolyzát kaseinu s olivovým olejem). Po dobu 6 hodinového sběru moče pacienta saturujeme tekutinami (minimálně 3x250 ml čaje). Po 3 hodinách se odebere další vzorek krve, po 6 hodinách poslední porce moče, změří se celkový objem moče za 6 hodin a pro analýzu se vezme vzorek cca 10ml moče. Laboratorní zpracování zahrnuje změření objemu moče za 6 hodin a stanovení koncentrace HPAB ve vzorcích séra a moče po hydrolýze. HPAB se stanovuje diazotační reakcí podle Bratton-Marshala s fotometrickým měřením.

Nepřímé funkční testy mají význam jako screeningové testy k průkazu pankreatické insuficience. Normální hodnoty výdeje močí za 6 hodin > 30.7% podaného množství pankreatickou nedostatečnost vylučují. Pomocnou hodnotou je hladina v séru ve 3.hodině testu s hranicí normálních hodnot > 25 µmol/l. Pankreatickou insuficienci lze vyloučit i při sníženém výdeji močí za 6 hodin tj. < 30.7% je-li prokázána normální hladina v séru. PABA test (ALTAB-test) se také s výhodou používá pro stanovení účinnosti pankreatické substituce enzymovými preparáty (např. Pankreolan, Panzynorm, Panpur, Kreon aj.). Při interpretaci výsledků PABA testu je nutno zvažovat komplexně možnosti falešně snížených hodnot v důsledku porušené funkce dalších orgánů, které se na výsledku testu uplatňují. Falešně pozitivní výsledeky jsme prokazovali při podání tablet s nižším obsahem substrátu (např. v důsledku přítomnosti racemátu tj. D,L-formy tyrosinu). Vzhledem k obtížím při interpretaci výsledků PABA-testu a relativně vysokému počtu falešně pozitivních výsledků již byla popsána celá řada modifikací. Jedná se především o stanovení tzv. PABA-indexu, stanovení PABA spolu s dalším markerem např. PAS nebo radioizotopu ¹⁴C ze značeného substrátu.

Dechový test s 13C-mixed triglyceridy (MTG-BT)
Provední MTG-BT testu. Pacient musí býti nalačno a je nutné vysazení pankreatické substituce nejméně 24 hodin před začátkem testu. Nepřímá stimulace testovacím pokrmem zahrnuje křehký, kukuřičný chléb s 50g tuku (nejlépe rostlinného margarinu) do kterého je přidáno 100 mg 13C-značeného triglyceridu. Odebrán je vzorek vzduchu před podáním testovacího pokrmu a pak po dobu 6ti hodin ve 30 minutových nebo 60ti minutových intervalech. Analýzu vzorků lze provést analyzátory IRMS nebo IR typu. Vyhodnocením je kumulativní výdej za 6 hodin, který v procentech k podanému substrátu vyjadřuje míru pankreatické insuficience. Hranicí normy je 22% pro MTG-BT test, test lze použít i k monitorování úspěšnosti pankreatické substituční léčby.

Stanovení chymotrypsinu (CHT) ve stolici.
Laboratorní stanovení chymotrypsinu je založeno na jednoduché reakci s chromogenním substrátem, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA. Chymotrypsin katalyzuje hydrolýzu a uvolnění barevného 4-nitroanilinu, který je stanoven fotometricky při 405 nm. Referenční hodnoty jsou > 140 nkat/g, hraniční pásmo je v rozmezí 70-140 nkat/g, patologické hodnoty < 70 nkat/g (hodnoty jsou pro stanovení při 30°C). Stanovení chymotrypsinu v stolici touto chromogenní metodou je jenoduché, specificita a senzitivita stanovení je však relativně nízká - pro těžké poruchy pankreatické funkce 67%, pro lehké a střední formy jen 39%. Výsledek testu může být falešně pozitivní vlivem mikrobiální flóry tlustého střeva, falešná negativita může být způsobena intraluminální degradací molekuly chymotrypsinu.

Stanovení elastázy-1 (EL-1) ve stolici.
Lidská pankreatická elastáza 1 je syntetizována acinárními buňkami pankreatu. Enzym je secernován pankreatickou šťávou do duodena a během střevní pasáže není degradována proteinová sekvence zvolená pro immunochemickou detekci. Stanovení elastázy vykazuje proto vyšší dg. přínos, na rozdíl od chromogenní metody stanovení chymotrypsinu ve stolici. Aktivita lidské pankreatické elastázy 1 ve vzorcích stolice odráží míru exokrinní pankreatické funkce. Laboratorní metoda je založena na imunologickém průkazu ELISA metodou s monoklonální protilátkou k lidské, pankreatické elastáze. Vzorek stolice je v laboratoři homogenizován v extrakčním nárazníkovém roztoku a po ředění 1:500 dále zpracován běžným ELISA postupem na mikrotitrační destičce s detekcí pomocí POD-streptavidin. Souprava obsahuje 5 kalibračních standardů v rozmezí 0.3-10.0 ng/ml. Referenční hodnoty jsou 200-500 µg/g stolice, hraniční pásmo je 100-200 µg/g, závažná pankreatická insuficience je stanovena při hodnotách < 100µg/g stolice. Imunochemické stanovení elastázy-1 není ovlivněno pasáží tlustým střevem, substituční terapií ani jinými faktory, které ovlivňují enzymové stanovení chymotrypsinu ve stolici. Specificita metody je 93%, senzitivita dosahuje pro těžkou pankreatickou insuficienci hodnoty 100%, pro střední a lehké formy 87%. Tento test je běžně používán v pediatrii k průkazu cystické fibrózy se specificitou i senzitivitou téměř 100%.

Beta-karoten
ß-karoten je retinoid, prekursor vitaminu A (z jedné molekuly ß-karotenu vznikají 2 molekuly A-vitaminu), jeho zdrojem je především ovoce a zelenina. A-vitamin i ß-karoten jsou rozpustné v tucích, jejich hladina v séru je proto závislá na trávení a vstřebávání tuků. V cirkulaci je ß-karotén vázán z 80% na LDL, 8% na HDL a z 12% na VLDL lipoproteiny. Ze sérových karotenoidů tvoří ß-karoten asi 25%. Z klinického hlediska je významný velmi krátký poločas ß-karotenu resp. jeho rychlá konverze na A-vitamin.

Stanovení ß-karotenu se provádí pomocí HPLC nebo extrakční metodou (vytřepání do petroléteru/chloroformu, nebo jiných organických rozpouštědel) se spektrofotometrickým měřením. Referenční hodnoty závisí na postupu stanovení, běžně je uváděno rozmezí pro extrakční metodu tj.stanovení celkových sérových karotenoidů, 0.90-4.60 µmol/l, užší pásmo referenčních hodnot je 1.12-3.72 µmol/L. Pro screening malabsorpčního syndromu u dospělých se uvádí pouze dolní hranice 0.93 µmol/l.Přestože extrakční metodika stanovuje celkové karotenoidy, hodnoty jsou uváděny jako ß-karoten. Pro HPLC techniku specificky stanovující pouze ß-karotén je popsáno referenční pásmo 0.37-74 µmol/l. Hladina ß-karotenu není signifikantně rozdílná v závislosti na pohlaví, u mužů jsou však hodnoty nižší než u žen.

Klinický význam má stanovení ß-karotenu především jako screeningový test při podezření na malabsorpční syndrom. Zvýšená hladina ß-karoténu je popsána u hypothyreózy, diabetes mellitus, myxedému, nefrotického syndromu, hyperlipoproteinémií a u žen v těhotenství.

Zátěžový test s ß-karotenem
Zátěžový test s ß-karotenem porovnává hladinu nalačno a vzestup po zátěži. Pacientovi je podávána dávka 15000 IU s jídlem po dobu tří dnů. Normální hodnotou je vzestup oproti hodnotě nalačno o > 65 µmol/l. Tento zátěžový test je klinicky používán velmi zřídka, běžněji je používán zátěžový test s A-vitaminem.

Toleranční test s A-vitaminem
A-vitamin je v tuku rozpustný vitamin, molekulové hmotnosti 286.44 existující ve dvou přirozených formách - retinol (A₁) a 3-dehydroretinol (A₂); prekursorem A-vitaminu je ß-karoten. A-vitamin (Axeroftol) je podán ve formě esteru rozpustného v tucích, který je hydrolyzován pankreatickými enzymy a v enterocytu pak dochází k jeho reesterifikaci nejčastěji s kyselinou palmitovou; v plazmě se váže na specifický lipoprotein (retinol vázající protein).

Provedení zátěžového testu. Pacient přichází nalačno, je odebrán vzorek krve a pak je podána zátěž 5000 IU A-vitaminu/kg váhy a tekutina (čaj). Za 3 a 5 hodin po podání A-vitaminu je odebrán vzorek krve pro analýzu. Laboratorní stanovení A-vitaminu v séru je možno provádět extrakční metodou se spektrofotometrickým měřením. Základní metodika podle Carr-Price je založena na reakci s chloridem antimonitým, nutná je korekce na ß-karoten. Moderní metodiky stanovení A-vitaminu využívají separačních možností HPLC.

Referenční hodnoty A-vitaminu v séru jsou v rozmezí 1.8-2.3 µmol/l, klinicky se prosté stanovení sérové hladiny využívá jen zřídka. Zátěžový toleranční test s A-vitaminem je hodnocen vzestupem hladiny v séru za 3 a 5 hodin po podání testovací zátěže. Normální hodnoty za 3 hodiny jsou v pásmu 3.6-12.6 µmol/l, za 5 hodin 7.2-24.6 µmol/l. Patologický výsledek testu je při hodnotách < 3.6 µmol/l za 3 hodiny resp. < 7.2 µmol/l za 5 hodin.

Klinický význam má toleranční test s A-vitaminem při diferenciální diagnostice malabsorpčního syndromu. Pozitivita testu koreluje s vylučováním tuku ve stolici.

Toleranční test s D-xylózou
Zátěžový test s D-xylózou (xylózový absorpční test) je indikován v diferenciální diagnostice malabsorpčního syndromu. D-xylóza je 5-uhlíkový monosacharid (pentóza), který je asi ze 60% pasivně absorpován v proximální části tenkého střeva (duodenojejunální) a z cirkulace je eliminován ledvinami. Clearance cca 87% je dána tubulární resorpcí D-xylózy. Stanovujeme hladinu v séru a v moči, nalačno a za 5 hodin po podání zátěže (pro stanovení odpadu močí je prováděn 5 hodinový sběr moče).

Provedení testu. Pacient přijde nalačno, odebere se vzorek krve a moče a podá se zátěž D-xylózou. U dospělých osob se podává 25g D-xylózy, u dětí 5g; alternativní postup (především u dětí) doporučuje 0.5g/kg váhy. Po dobu 5 hodinového sběru moče pacienta saturujeme tekutinami (minimálně 2x250 ml čaje). Po 2 hodinách se odebere další vzorek krve, po 5 hodinách poslední porce moči. Změří se celkový objem moče za 5 hodin a pro analýzu se vezme vzorek cca 10ml moče. Variantní uspořádání testu umožňuje odběr krve i v jiném intervalu než 2 hodin, u dětí se odebírá obvykle krev již za 1 hodinu.

Stanovení D-xylózy je založeno na reakci 4-bromanilinu s furfuralem, který vzniká dehydratací D-xylózy v kyselém prostředí. Vzniklý barevný produkt je měřen fotometricky při 520nm. Reakce probíhá v přítomnosti thiomočoviny, která minimalizuje tvorbu interferujících barevných produktů. Vzorky krve je nutno před stanovením D-xylózy deproteinovat, doporučená je procedura se síranem zinečnatým a hydroxidem barnatým. Alternativní postupy pro stanovení D-xylózy jsou plynová chromatografie, HPLC a enzymová metoda s D-xylózo-oxidoreduktázou (s NADP⁺).

Hladina v séru za 1 hod po podání D-xylózy je 1.40-3.80 mmol/l, za 2 hodiny 2.13-3.86 mmol/l, za 3 hodiny 1.27-2.80 mmol/l, za 4 hodiny 0.73-1.93 mmol/l za 5 hodin 0.40-1.20 mmol/l. Patologickým výsledkem je hladina za 2 hodiny u dospělých po podání 25g < 1.67 mmol/l u dětí po podání 5 g < 1.33 mmol/l. V 5ti hodinovém sběru moče je u dětí 5-12 let po podání 5g D-xylózy patologickým výsledkem hodnota < 0.8g/5hod (širší rozmezí normálních hodnot je 0.5-1.65 g/5hod), u dospělých osob po podání 25g hodnota < 4g/5 hod (podle některých autorů je jako patologický hodnocen nález <5g/5 hod), u osob starších 65 let klesá hraniční hodnota na 3.5g/5hod. Při podání D-xylózy podle váhy (především u malých dětí) je normální rozmezí xylózy vyloučené močí za 5 hodin 10-33% podaného množství.

Toleranční test s D-xylózou je obvykle indikován k potvrzení střevní malabsorpce u gluténové enteropatie (céliakální sprue), tropické sprue. Výsledek výdeje močí je ovlivněn funkcí ledvin. Falešně pozitivní výsledek může být stanoven např. při zvracení, dehydrataci, myxedému, ascitu, edému. Celá řada léků snižuje exkreci D-xylózy ledvinami - např. kyselina aminosalicylová, acetylosalicylová, digitalis, indomethacin, neomycin a další. ¹⁴C-D-xylózový dechový test je variantou xylózového absorpčního testu.

Laktózový toleranční test
Laktózový toleranční test je nepřímým měřením aktivity intestinální laktázy, enzymu kartáčového lemu enterocytu, který hydrolyzuje laktózu na glukózu a galaktózu. Laktózový test pro diferenciální diagnostiku laktózové nesnášenlivosti se klasicky prováděl hodnocením hladiny glykemie za 15, 30, 60 a 90 minut po perorálním podání 50g laktózy v 500 ml vody. Průkazem deficitu laktázy je vzestup glykemie o méně než 1 mmol/l. Laktózový test lze nověji hodnotit také dechovými testy a to jak H2 testem, kdy ve vydechovaném vzduchu stoupá koncentrace vodíku následkem bakteriálního rozkladu laktózy nerozštěpené laktózy v tlustém střevě, nebo detekcí uhlíku 13C po podání značené 13C-laktózy. Velmi přesné výsledlky poskytuje kombinovaná metoda 13C/H2-laktózový test, kdy je hodnoceno enzymatické štěpení laktózy (markerem je 13C uhlík) a současně jako korekce motility, pasáže je použito bakteriálního štěpení v tlustém střevu (markerem je H2).

Dechové testy
Moderní, neinvazivní funkční diagnostika v gastroenterologii zahrnuje celou řadu dechových testů. Po podání testovaného substrátu jsou odebírány vzorky vydechovaného vzduchu a je měřena koncentrace vodíku nebo CO2 podle typu testu. U H2 dechových testů je měřena koncentrace H2 plynovou chromatografií, u testů značených stabilním izotopem uhlíku 13C je měřena koncentrace CO2 resp. poměr frakce CO2 s atomem uhlíku 13C a 12C. Existují i testy, kdy je substrát značen radioizotopem uhlíku 14C, tyto testy nelze v graviditě provádět, jsou na ústupu a postupně jsou nahrazovány testy s uhlíkem 13C. Existují tři metodické přístupy k analýze vydechovaného vzduchu a stanovení poměru koncentrace 13CO2 : 12CO2, které se liší principem detekce a analytickou citlivostí. Nejpřesnější je metoda poměrové hmotnostní spektrometrie (IRMS Isotope Ratio Mass Spectrometry), kde pro analýzu stačí několik mikrolitrů vzorku vzduchu a pro tuto technikou jsou určeny soupravy, kde vydechovaný vzduch je sbírán do 5-10 ml zkumavek. Druhým přístupem je detekce v infračerveném spektru (NDIRS - Nondispersive Isotope-selective Infrared Spectroscopy). Analyzátory tohoto typu jsou řádově lacinější, menší, nevyžadují specielní obsluhy a jsou typu POCT (Point Of Care Testing), vhodné např. pro ambulance odborného lékaře. Nižší citlivost IR analyzátorů vyžaduje mnohem větší objemy vzorku vzduchu (více než 100 ml) a pro odběr vzduchu se používají sáčky z hliníkové fólie. Třetím typem je analyzátor LARA založený na optogalvanickém měření vlastností laserového paprsku, analyzátor tohoto typu je uzavřeným systémem a u nás zatím nikde instalován není.

V současné době existuje široká škála značených substrátů pro funkční testy žaludeční pasáže (¹³C-acetát), pankreatické funkce (¹⁴C-cholesteryl-octanoid, ¹³C-triolein, amylóza), střevní malabsorpce (¹⁴C/¹³C-xylóza,laktóza,palmitát), jaterních funkcí (¹³C-aminopyrin, leucin),¹³C-močovina k detekci ureázy při infekci Helicobacter pylori. K provedení dechových testů jsou dodávány soupravy, které obsahují definované množství substátu, 2 až 6 odběrových nádobek pro vzorky vydechovaného vzduchu (podle uspořádání testu) a odběrovou trubičku. Screeningové testy jsou dodávány v balení, ve kterém může nemocný po odběru vzorky zaslat do laboratoře poštou.

Screeningové programy v gastroenterologii
Screeningové (vyhledávací) programy jsou zaměřeny na časnou diagnostiku onemocnění, které jinak zůstávají, v této časné fázi, nerozpoznány. Screeningové programy se provádějí u asymptomatických osob (bez příznaků onemocnění). U definovaných tzv. vysokorizikových skupin se jedná o programy dispensarizační. Pro tyto vyhledávácí programy se musí přesně definovat populace, která má být screeningem testována, interpretace použitých testů a způsob dalšího vyšetření resp. léčby při pozitivním výsledku testu. Gastroenterologický screening, který zahrnuje tři základní programy lze provést ze vzorku stolice. - Screening okultního krvácení pro vyhledávání a časnou diagnostiku kolorektálních nádorů tetstem Haemoccult je vypracován detailně, je stanoven interval screeningu, věkové rozmezí i následný koloskopický vyšetřovací program při pozitivním průkazu okultního krvácení. - Screening infekce Helicobacter pylori, který je kancerogenem 1.třídy, je v současné době možno provádět immunochemickém průkazem antigenu Helicobacter pylori ve stolici. - Screening glutenové enteropatie (céliakální sprue), která může být aktivována graviditou a přináší zvýšené riziko malignit gastrointestinálního traktu je možný detekcí sekrečních IgA protilátek ke gliadinu nebo průkazem protilátek ke tkáňové transglutamináze ve stolici.

Test okultní krvácení ve stolici
Detekci okultního krvácení - FOB (Fecal Occult Blood) je nutno specifikovat z hlediska klinické indikace. Screening, jako úvodní metoda depistážních programů pro vyhledávání kolorektálních nádorů u asymptomatických jedinců, je nutno provádět testem, který splňuje stanovená kriteria. Depistážní programy jsou založeny na opakovaném stanovení v pravidelných intervalech jednoho až dvou let. V případě pozitivního výsledku testu musí následovat cílené gastroenterologické (endoskopické) vyšetření k objasnění příčiny pozitivity testu. Z těchto důvodů nelze pro screening použít testů imunochemických, které mají výrazně vyšší citlivost a poskytují 4 - 7% falešnou pozitivitu. Haemoccult testem jsme ve studii našeho pracoviště prokázali u > 95 tisíc asymptomatických osob pozitivitu 2.8%, falešná pozitivita testovaná při srovnání s imunochemickými testy byla nulová. Imunochemické testy jsou vhodné pro detekci (vyloučení) krvácení u symptomatických nemocných, kde test okultního krvácení je jedním z řady vyšetřovacích postupů. Kontrolovaný screening FOB testem významně snižuje incidenci kolorektálního karcinomu.

Screeninový test okultního krvácení - Haemoocult.
Doporučení (guidelines) MZ ČR pro vyhledávání a časnou diagnostiku kolorektálních nádorů jednoznačně specifikují vhodný, doporučený a ověřený test, kterým je Haemoccult. Test je založen na pseudoperoxidázové reakci hemoglobinu s guajakovou pryskyřicí. Bezbarvá leukoforma je v přítomnosti peroxidu vodíku a hemoglobinu oxidována na barevnou (chromogenní) formu. Vzhledem k chemickému principu oxidační reakce může být výsledek testu ovlivněn přítomností jiných oxidačních látek (C-vitamin), přítomností hemoglobinu z potravy (maso, krev), falešně pozitivní výsledek může být způsoben i přítomností rostlinných peroxidáz (některé druhy kořenové zeleniny).

Provedení testu. Pro screening je dodávána souprava, která obsahuje 3 testy se dvěma okénky a plastové nebo dřevěné špátle na odběr stolice. Pacient odebere vždy dva různé vzorky ze tří po sobě následujících stolicí, které rozetře na označená místa testu, testovací okénka uzavře a testy odešle do laboratoře. Laboratorní zpracování spočívá v aplikaci detekčního reagens na opačnou stranu okének a zhodnocení případné barevné změny. Hodnocení je kvalitativní, jako pozitivní je hodnocen každý test, kde dochází ke specifickému modro-zelenému zabarvení.

Immunochemický průkaz krve ve stolici.
Citlivý test, který je určen, na rozdíl od screeningového Haemoccult testu, k vyloučení krvácení do GIT. Test je založen na imunochemické detekci hemoglobinu reakcí s monoklonální protilátkou proti lidskému hemoglobinu. Na imunochemickém principu jsou založeny testy hemaglutinační, latexové imunoprecipitace, radiální imunodifúze i imunoafinitní chromatografie. Detekce proteinu (lidského hemoglobinu) monoklonální protilátkou vylučuje možnost ovlivnění jiným zdrojem hemoglobinu (potrava), odpadá interference chemických látek, není nutna specielní dieta. Citlivost imunochemických testů je výrazně vyšší; v závislosti na technice i < 0.1 mg hemoglobinu/g stolice. K imunochemickým testům patří např. latexový test Hemolex, na principu reversní pasivní hemaglutinace Heme-Select, imunoafinitní chromatografie ImmoCare, FOB test Dialab, Hexagon OBTI, Actim test a další.

Provedení testu. Imunochemické testy se výrazně liší podle typu použité techniky. V poslední době je nejrozšířenější varianta imunoafinitní chromatografie. Pacient odebere 1 vzorek stolice do odběrové nádobky se stabilizujícím roztokem. Laboratorní zpracování spočívá v aplikaci kapky extraktu na test a odečtení 1 nebo 2 barevných proužků, které detekují přítomnost pouze protilátky s barevným markerem (negativní test, 1 barevný proužek) nebo vznik komplexu antigenu-protilátky (pozitivní test, 2 barevné proužky). Hodnocení je opět pouze kvalitativní.

Stanovení calprotectinu ve stolici
Calprotectin je kalcium vazebný protein molekulové hmotnosti 36.5 kD složený ze dvou těžkých řetězců a jednoho lehkého řetězce. Calprotectin jako marker stanovený ve stolici vykazuje nižší variabilitu než hemoglobin a je vhodným ukazatelem při diagnostice i monitorování terapie střevních zánětlivých onemocnění - ulcerózní kolitidy a Crohnovy choroby. Stanovení koncentrace ve vzorku stolice s cut-off hodnotou 30 mg/l vykazuje specificitu 97% a senzitivitu 100% pro diferenciální diagnostiku mezi akutní Crohnovou chorobou a syndromem IBS (irritable bowel syndrome). Calprotectin ve stolici je rovněž testován jako marker kolorektálního karcinomu.

Diagnostika Helicobacterové infekce
Bakterie Helicobacter pylori (dříve Campylobacter) je známa řadu desetiletí, její klinický význam však vzrostl teprve v roce 1982, kdy Warren a Marshal popsali přímý vztah k epithelu žaludeční sliznice u nemocných s gastritidou nebo žaludečními vředy. Pro diagnostiku infekce Helicobacterem pylori lze použít testů invasivních, vyžadujících odběr bioptického vzorku žaludeční nebo duodenální sliznice nebo testů neinvasivních. Kultivační test vykazuje nejvyšší sensitivitu i specificitu, nevýhodou je však značná citlivost bakterie Helicobacter pylori ke kyslíku, což vyžaduje specielní podmínky odběru a transportu. Rychlý ureázový (CLO) test je založen na intensivní aktivitě ureázy (povrchový marker bakterie Helicobacter pylori) a je rutinním průkazem při endoskopii. Serologický průkaz protilátek k Helicobacter pylori v séru, ve slinách nebo ve vzorku moči patří k metodám neinvazivním, jde však o průkaz přítomnosti protilátek, nikoliv aktivní infekce Helicobacter pylori. Z tohoto aspektu je pro screening i primární, neinvazivní diagnostiku vhodný především dechový test založený na detekci ureázové aktivity - UBT (Urea Breath Test), kdy je stanovována změna poměru 13CO2 : 12CO2 ve vydechovaném vzduchu po rozštěpení perorálně podané močoviny značené stabilním izotopem uhlíku 13C, nebo detekce povrchových antigenů Helicobacter pylori ve vzorku stolice. Obě dvě uvedené metodiky jsou doporučeny také závěry Evropské pracovní skupiny - EHPSG (European Helicobacter Pylori Study Group) podle Maastrichtského konsenzu ze dne 21. a 22. září 2000 nejen pro primární diagnostiku, ale i k ověření úspěchu eradikační terapie.

Stanovení protilátek k Helicobacter pylori.
Protilátky v séru lze detekovat celou řadou imunologických a sérologických technik jako je imunobloting, imunofluorescence, hemaglutinace, fixace komplementu, latexové testy apod. Nejrozšířenější metodou je však bezesporu ELISA - jednoduchá, rychlá, levná a spolehlivá technika. Specificita a senzitivita metody je však značně závislá na použitém antigenu - od celých buněk, přes ultrazvukový sonikát, glycinový extrakt až k purifikovaným proteinům. V roce 1989 byla popsána izolace vysokomolekulárního povrchového proteinu (označovaný HM-CAP, high molecular weight cell-associated protein), jehož specificita a senzitivita dosahuje 95%.

Sérologický průkaz protilátek k Helicobacter pylori má klinický význam především pro dlouhodobé sledování po léčbě, k monitorování úspěchu eradikace Helicobacter pylori, pokles IgG po 6 měsících léčby na hodnoty < 50% vykazuje specificitu 95% a senzitivitu 97%. Mezi indikace patří screening rizikových pacientů, např. u nemocných s transplantací ledvin, kdy Helicobacterová infekce zvyšuje riziko vzniku peptického vředu a krvácení.

Protilátky k Helicobacter pylori lze immunologickými technikami prokázat i ve slinách nebo v moči, existují dále celá řada tzv. rychlých testů (Rapid test), kdy protilátky k Helicobacter pylori prokazujeme z plné krve, po kapilárním odběru během několika minut immunoafinitní chromatografickou metodou. Specificita a senzitivita těchto testů je relativně nízká - 70 až 85%.

K serologické diagnostice protilátek k Helicobacter pylori patří i průkaz antigenů cagA, vacA a iceA, jejichž přítomnost specifikuje kmeny Helicobacter pylori s vyšší patogenicitou. Pro průkaz těchto antigenů se používají klasické ELISA testy na mikrotitračních destičkách nebo PCR techniky. Průkaz Helicobacter pylori a jeho kmenů metodami PCR je ve fázi klinického testování, v rutinní diagnostice se zatím nevyužívá.

Průkaz antigenu Helicobater pylori ve stolici
Tato neinvasivní metoda ELISA se provádí na běžných mikrotitračních destičkách pro 96 vzorků. Vzorek stolice je připraven v koncentraci 200 mg/ml a centrifugován 5 minut při 7000 xg. Další postup je běžnou ELISA technikou, s TMB substrátem a fotometrickým vyhodnocením při 450 nm. Existuje několik modifikací ELISA metody, které dosahují specificity i senzitivity 98%. Z hlediska odběru vzorku je metoda pro pacienta nenáročná, laboratoře mají odběrové nádobky s plastikovým jádrem v podobě lžičky, kterou je vzorek stolice odebrán a uzavřen. Vzorky stolice je možno uchovávat při -20oC i několik měsíců.

Detekce Helicobacter pylori dechovým testem.
Dechový test s močovinou značenou uhlíkem 13C (13C-UBT) je dnes považován za zlatý standard průkazu infekce způsobené Helicobacter pylori. Princip testu je založen na detekci značeného oxidu uhličitého, který vzniká štěpením substrátu - močoviny enzymem, ureázou, která je jako povrchový protein produkována bakterií Helicobacter pylori. Metoda testu byla popsána již v roce 1987 a existuje řada modifikací, které se liší především v množství podávaného substrátu (50-100 mg), podání roztoku kyseliny citrónové nebo přírodního pomerančového džusu a časovém intervalu odběru vzorků vydechovaného vzduchu. Jednou z variant je tzv. Evropský standardní protokol, kdy provedení testu je následující. Pacient musí být pro provedení testu na lačno (nejméně 2 hodiny nesmí jíst, pít a kouřit). Odebírají se dva nebo tři vzorky vydechovaného vzduchu do zkumavky, důležité je zajistit, aby byl zachycen vzduch z konečné fáze vydechnutí. Následuje vypití 200 ml roztoku kyseliny citrónové nebo přírodního, neslazeného pomerančového džusu a po 5-10 minutách je podáno 100mg močoviny značené atomem uhlíku 13C (dětem je podáváno poloviční množství 50 mg). Přesně po 30 minutách jsou odebrány dva nebo tři vzorky vydechovaného vzduchu do zkumavek stejným způsobem jako na začátku testu. Vzorky vzduchu ve zkumavkách jsou analyzovány technikou IRMS. Varianta protokolu pro IR - POCT analyzátory se liší pouze v tom, že vzorky vydechovaného vzduchu jsou odebírány do sáčků z hliníkové fólie a jsou analyzovány ihned v ambulanci nebo laboratoři, a výsledek testu je znám již během 10 minut. Pro hodnocení testu je stanoveno kriterium změny poměru 13CO2 : 12CO2 větší než 5 promile mezi vzorkem v čase T30 oproti vzorku T0. Na výsledek testu má vliv motilita a anatomie žaludku, porušené vyprazdňování, léčba inhibitory protonové pumpy, antibiotiky nebo preparáty vizmutu. Doporučeno je proto provádět dechový test 4-6 týdnů po ukončení eradikační terapie.

Screening céliakie - serologické markery
Céliakální sprue (CS, glutenová enteropatie) je onemocněním, které se projevuje intolerancí k pšeničnému gliadinu (lepku) resp. dalším zásobním proteinům (prolaminům) příbuzných obilovin, ječmene, žita a ovsa. Glutenová enteropatie je geneticky podmíněným autoimunitním onemocněním. Současné poznatky přinášejí doklady o heterogenitě klinické prezentace tohoto onemocnění.

Klasická forma, diagnostikovaná často již v dětském věku, je provázena hubnutím, průjmy a histologickým průkazem atrofické, ploché sliznice tenkého střeva (průkaz enterobiopsií). Základní léčbou je dietní režim s vyloučením lepku, tzv. bezlepková (gluten-free) dieta. Po nasazení této léčby dochází u klasické formy k normalizaci klinického stavu i laboratorních testů. Další formy nejsou běžně diagnostikovány a tvoří téměř 80% případů, které jsou schematicky rozděleny do dalších skupin v modelu ledovce. Němá (silent) forma céliakie je charakterizována patologickými hodnotami sérologických testů, a při enterobiopsii nalézáme charakteristické změny histologického obrazu céliakie. Latentní forma je charakterizována pouze pozitivními sérologickými testy, při enterobiopsii je nalezena normální architektura sliznice. Jako potenciální forma je označena populace s genetickou predispozicí tj. HLA DQw2 antigenem a zvýšeným počtem intraepiteliálních lymfocytů resp. g/d IEL sybtypů. Incidence všech forem sumárně je podle současných evropských studií 1:200 až 1:250.

Serologické markery céliakie zahrnují protilátky ke gliadinu třídy IgA a IgG (AGA-A, AGA-G), protilátky k retikulinu (ARA) a endomysiu (EmA) třídy IgA a protilátky ke tkáňové transglutamináze třídy IgA a IgG (atTG-A, atTG-G). Žádný z uvedených markerů není 100% specifickým a současně 100% senzitivním, senzitivita a specificita těchto testů se pohybuje v rozmezí 31 -100% v závislosti na použitém antigenu/substrátu, nastavení cut-off hodnoty, použité metodice a standardizaci testu. Algoritmy screeningových programů (obr. 5) zahrnují sekvenční nebo i paralelní stanovení jednotlivých markerů, pozitivní výsledek však musí být v každém případě potvrzen histologickým vyšetřením. V remisi při bezlepkové dietě hladina protilátek klesá a proto jejich stanovení může být velmi dobře použito pro dlouhodobé sledování, follow-up, a monitoring dodržování bezlepkové diety.

Protilátky ke gliadinu (AGA) - IgA a IgG
Peptidové fragmenty gliadinu, proteinů pšeničného glutenu (lepku) patří k základním etiopatogenetickým faktorům céliakie. Detekce protilátek třídy IgA a IgG proti gliadinu jsou proto nejčastěji a nejdéle používanými serologickými markery. ELISA metody detekce AGA jsou běžně dostupné a z uvedených markerů CS jsou AGA nejlevnější. Ve screeningových programech jsou často používány jako první test. Citlivost a spolehlivost detekce má značnou variabilitu a podstatně je ovlivněna stupněm purifikace použitého antigenu. Antigliadinové protilátky AGA třídy IgA mají význam především pro posouzení aktuálního stavu a dodržování bezlepkové diety, (senzitivita 73-89%, specificita 72-89%), IgG protilátky mají dlouhodobý profil, význammají u nemocných s deficitem IgA (senzitivita 78-82% a specificita 66-85%). Metody, které používají jako antigen purifikovaný a-gliadin vykazují vyšší specificitu. V laboratoři ÚKB VFN v Praze používáme vlastní antigen - a-gliadin purifikovaný IE chromatografií na SP-Sephadexu. Referenční hodnoty závisí na použitém standardu.

Protilátky k endomysiu (EmA) -IgA
Céliakie patří k autoimunitním onemocněním a prokazujeme proto přítomnost řady autoantigenů, např. k endomysiu, což je pojivový, tkáňový protein hladkého svalu, lokalizovaný mezi myofibrilami. Endomysiální protilátky jsou velmi spolehlivým markerem céliakie (senzitivita 83-95% a specificita 94-99%), a ve screeningových algoritmech jsou doporučeny jako druhý krok, indikující histologický průkaz. Metoda detekce je imunofluorescenční, jako substrát byla původně použita svalovina jícnu opic, ověřeny jsou nyní i další substráty např. svalovina pupečníku. Laboratorní technika vyžaduje immunofluorescenční mikroskop, hodnocení testu není zcela jednoduché a vyžaduje dlouhodobé zkušenosti. Průkaz EmA protilátek by měl být proveden v několika ředěních vzorku séra od 1:5 (pro základní screening) až 1:40 (průkaz onemocnění). Vzhledem k finanční náročnosti testu je většinou prováděno hodnocení pouze v jediném ředění, nejčastěji 1:20. Protilátky ke tkáňové transglutamináze, která je vlastním chemickým substrátem endomysia, lze stanovit klasickou ELISA metodou a je proto výhodnější pro běžnou, rutinní diagnostiku.

Protilátky ke tkáňové transglutamináze (atTG) - IgA a IgG
Tkáňová transglutamináza má přímý vztah k patogenezi onemocnění a byla popsána jako vlastní, chemický substrát endomysia, stanovení atTG má proto rovněž velmi vysokou diagnostickou efektivitu, podobně jako EmA protilátky (senzitivita 87-97% a specificita 88-98%). Stanovení atTG je prováděno klasickou metodou ELISA, což je pro rutinní diagnostiku technika dostupnější než immunofluorescenční průkaz EmA. Protilátky atTG lze na rozdíl od EmA stanovovat ve třídě IgA i IgG, což má význam pro nemocné se selektivním deficitem IgA. Metoda byla popsána s použitím morčecího antigenu, který je použit ve většině starších souprav, novější soupravy již používají jako antigen tkáňovou transglutaminázu izolovanou z lidských buněk, z lidských erythrocytů, nebo rekombinantní tTG izolovanou na E.coli. Referenční hodnoty se liší u jednotlivých souprav, většinou je pro IgA protilátky uváděna horní hranice normy 10 - 15 IU/l, některé soupravy definují i tzv. gray-zone v rozsahu 10 - 20 IU/l.

Stanovení protilátek ke gliadinu nebo atTG ve stolici
Vyšetření vzorku stolice je výhodné pro screeningové programy v gastroenterologii. Stanovení sekrečních IgA protilátek ke gliadinu je dalším novým imunochemickým testem, komerčně dostupným od roku 2000. Test je založen na ILMA (ImmunoLuminoMetric Assay) principu s luminiscenčním měřením, markerem je akridinium ester, antigenem je surový gliadin. Test stanovuje sekretorické IgA protilátky - AntiGliadin-scIgA, normální hodnoty jsou do 100 mg/g stolice, a klinická senzitivita je 81%, specificita 97%. Nově existuje i ELISA detekce IgA protilátek ke tkáňové transglutamináze ve stolici.