Dechové testy s uhlíkem 13C, Funkční testy v gastroenterologii
Ceterum 1998/12, str.18-19


Dechové testy jsou moderní, flexibilní variantou funkční diagnostiky v gastroenterologii. V současné době je funkční diagnostika v situaci, kdy na trhu není dostupný ALTAB test pro diagnostiku exokrinní funkce pankreatu ani souprava stanovení chymotrypsinu ve stolici, není dostupný stimulační pentagastrin pro funkční testy žaludeční sekrece. Pro funkční diagnostiku tenkého střeva je velmi ojediněle používán zátěžový test s xylózou.

Dechové testy jsou používány již řadu let. První soupravy byly založeny na měření vydechovaného vodíku - H2. Koncentrace vodíku ve vydechovaném vzduchu stoupá po hydrolýze substrátu, např. laktózy, laktulózy, sacharózy v průběhu střevní pasáže. Tyto testy se dosud používají v diagnostice malabsorpčního syndromu, především v pediatrii. Další testy byly založeny na značení specifických substrátů radioizotopem uhlíku 14C. K dispozici je poměrně široká škála zahrnující detekci Helicobacterové infekce značenou močovinou, testy s 14C-xylózou, substráty pro jaterní funkce a další. Nevýhodou těchto testů je přítomnost radioaktivního izotopu, který je podáván jako testovací substance nemocnému a laboratorně vyžaduje měření koncentrace obdobně jako RIA metodiky.

Významný posun proto znamenají testy založené na značení specifických substrátů izotopem uhlíku 13C. Tento izotop není radioaktivní, jde o přirozeně se vyskytující, stabilní izotop. Lidské tělo - jeho organická složka - obsahuje značné množství atomů uhlíku; 1.1% atomů uhlíku je přirozeným 13C izotopem. Podání takto označeného substrátu tedy není pro lidský organizmus ničím cizorodým. Celá řada výrobců dnes již nabízí širokou škálu 13C značených substancí, které pokrývají komplexně funkční diagnostiku v gastroenterologii. Schema (obr.č.1) ukazuje základní nabídku testů.

dech1.jpg (65882 bytes)

obr.1

Nejrozšířenějším testem je detekce Helicobacter pylori soupravou s 13C-močovinou. Princip všech dechových testů s 13C-substráty je schematicky na obrázku č.2. Perorálně je podána značená substance (v případě detekce Helicobacter pylori močovina). Tato substance je štěpena enzymem, jehož aktivita je mírou detekované funkce. Přítomnost bakterie Helicobacter pylori je detekována pomocí ureázy, která je přítomna mezi povrchovými proteiny bakterielní struktury. Rozštěpením substrátu je uvolněn atom uhlíku 13C. Metabolicky je uhlík zabudován do molekuly CO2 a koncentrace CO2 obsahující izotop 13C je měřena ve vydechovaném vzduchu.

dech2.jpg (55919 bytes)

 

Soupravy dechových testů s 13C-substrátem. Součástí každé soupravy je vlastní testační substance, např. 13C značená močovina, odběrové zkumavku typu Vacutainer a trubičky, pro naplnění zkumavek. Postup testu je pro pacienta velmi jednoduchý. Rozpustí testační substanci v definovaném množství vody, naplní dechem zkumavku označenou časem 0, nebo BLANK. Vypije testační substrát a v definovaném časovém intervalu např. 30 minut opět naplní dechem další zkumavky. Počet zkumavek se liší uspořádáním testu, některé soupravy obsahují zkumavky pro každý časový interval zdvojené - měření v duplikátu, řada funkčních testů obsahuje zkumavky pro hodnocení časové, kinetické závislosti tj. odběr např. po 15 nebo 30 minutách. Zkumavky nemocný uloží zpět do krabičky, která je upravena jako poštovní zásilka. Vzorky jsou odeslány do laboratoře, která provede změření koncentrace 13C-CO2 a vyhodnotí výsledek testu.

dech3.jpg (84731 bytes)

obr.3

Stanovení koncentrace 13C-CO2. Měření koncentrace CO2 resp. poměru 13C-CO2 a 12C-CO2, který je ve vydechovaném vzduchu samozřejmě přítomen, je umožněno několika technikami. Pro laboratorní zpracování jsou k dispozici systémy jednodušší, založené na specifické absorpci v IR oblasti a systémy dokonalejší s detekcí hmotnostní spektrometrií (MS). IR systém vyžaduje výrazně větší objem vzorku (700 ml oproti 10 ml pro MS) a měřicí přesnost je cca 3x nižší než MS.

Systémem typu MS je např. automatický analyzátor dechových plynů firmy Analytical Precision (obrázek č.4). Analyzátor zahrnuje autosampler, zásobník na 280 vzorků (zkumavek typu Vacutainer), jednotku pro přípravu vzorku, plynovou chromatografii k separaci CO2, hmotnostní spektrometr (MS) a osobní počítač pro řízení procesu, zpracování a analýzu dat a tisk výsledků na připojené laserové tiskárně.

dech4.jpg (47125 bytes)

obr.4

Modul přípravy vzorků. Základem je robustní autosampler Model 222 XL firmy Gilson (Francie). Tento XYZ-souřadnicově řízený dávkovací systém je plně programovatelný a umožňuje uživateli definovat vzorky v libovolném pořadí a výběru. Nadstavbou je modul úpravy vzorku (obrázek č.5), především odstranění vody ze vzduchu. Tato procedura odlišuje systém Analytical Precision od obdobných GC-MS systémů (např. BreathMATplus) , u kterých je voda ze vzorku odstraněna až po GC separaci. Odstranění vody membránovou separační jednotkou před nástřikem na GC kolonu (systém firmy AP) podstatně zlepšuje separační parametry. Před vlastním měřením MS je aplikován puls referenčního plynu 12C-CO2.

dech5.jpg (37458 bytes)

obr.5

Měřicí modul hmotnostní spektrometr (MS). Na rozdíl od systémů GC-MS, kde výsledkem je hmotnostní spektrum vzorku je analyzátor dechových plynů vybaven poměrovým MS systémem, který vyhodnocuje v čase poměr hmotností 44, 45 a 46 pomocí tzv. triple-detektoru (obrázek č.6). Pro hodnocení funkčního testu je nutno stanovit rozdíl (přírustek) poměru 13C-CO2:12C-CO2. Vzhledem k tomu, že i kyslík se vyskytuje v různých přirozených, stabilních izotopech tj. 16O a 18O, je nutno detekovat nejen hmotnost 44, odpovídající 12C-16O2, hmotnost 45 odpovídající 13C-16O2, ale ještě i hmotnost 46 odpovídající 12C-16O18O. Stabilní izotop kyslíku18O tvoří asi 0.2%.

dech6.jpg (33006 bytes)

obr.6

 

Klinické aplikace 13C- dechových testů.

Základní a nejrozšířěnější aplikací je detekce Helicobacter pylori pomocí ureázového testu. Funkční diagnostika v gastroenterologii zahrnuje širokou škálu testů, pro které jsou k dispozici 13C-značené substráty (obrázek č.1). V současné době probíhá ve více než 25 evropských centrech ověřování dalších klinických aplikací, které jsou zaměřeny na funkční a metabolické poruchy. Tyto studie jsou zahrnuty do projektu ES. Německá firma INFAI, která úzce spolupracuje s výrobcem analyzátoru AP 2003 nabízí soupravy pro detekci Helicobacter pylori s 13C-močovinou, stanovení funkce pankreatu s 13C-značeným škrobem (detekce amylázy) nebo 13C-směsí triglyceridů (detekce lipázy), INFAI-MET s 13C-Na acetátem pro stanovení doby vyprázdnění žaludku.

Doporučená literatura

 

1. Hydrogen (H2) Breath Test in Man. Studies under experimental conditions and in clinical practice, U.Armbrecht, University Göteborg, 1988

2. 13CO2-Breath Test at the laboratory “Digestion-Absorption” Y.Ghoos, University Hospital Leuven, May 1996