Výsledky z praktik bloku molekulární biologie 2003

Izolace genetického materiálu

Izolace DNA z celé periferní krve pomocí izolačního kitu Wizard (Promega) - 6. týden.

Elektroforéza 3 ul izolované DNA na 0.7% agarózovém gelu v 1xTAE pufru (7. týden). M - velikostní DNA standard (Sigma, Broad range DNA marker),

Pondělí	1 (Karol) 0,26; 2 (Zuzka) 0,06; 3 (Jana) 0,36; 4 (Petra) 0,52; 5 (Monika) 0,34; 6 (opet Monika) 0,34; 7 (Ivana) 0,56; 8 (Radim (0,06); 9 (Filip) 0,08; 10 (Star) 0,16; 11 (Marta) 0,36.
Úterý	1 - 0,18; 2 - 0,22; 3 - 0,06; 4 - 0,36; 5 - 0,04; 6 - 0,03; 7 - 0,06; 8 - 0,34; 9 - 0,06; 10 - 0,14; 11 - 0,06; 12 - 0,13; 13 - 0,07.
Středa
Čtvrtek / Thursday	1- 0,24; 2 - 0,04; 3 - 0,08; 4 - 0,12; 5 - 0,14; 6 - 0,36; 7 - 0,18; 8 - 0,9; 9 - 0,04; 10 - 0,14; 11 - 0,02; 12 - 0,04; 13 - 0,9.
Pátek

Amplifikace DNA (gen Apo-E) pomocí PCR

(8. týden)

Sekvenci genu pro lidský apolipoprotein E naleznete zde. Po praktická cvičení byla zvolena metoda podle Kamboh MI et al. Atherosclerosis 1995;112(2):145-59 zde.
Sekvence primerů pro amplifikaci fragmentu exonu 3: P1: 5'-GCGGACATGGAGGACGT-3'; P2: 5'-GGCCTCCTACACTGCCAG-3'
Podmínky PCR reakce: Úvodní denaturace - 95°C 5 min; 30 cyklů: Td=95°C - 30s, Ta=62°C - 30s, Te=72°C - 60s; terminální elongace 72°C - 10min

Elektroforéza 5 ul produktu PCR na 1.25% agarózovém gelu v 1xTAE pufru (9. týden).

Pondělí

M - DNA Marker; 1 - JM; 2 - G klíč; 3 - 5; 4 - 3; 5 - jan; 6 - Švejcarová; 7 - Duchoňová; 8 - Krejčovičová; 9 - K+Z; 10 - Debnár; 11 - 9; 12 - Kolníková; 13 - Regina; M - DNA Marker

Úterý

M - DNA Marker; 1 - Boten; 2 - 2+P; 3 - Kafka; 4 - Monika; 5 - MonikaM; 6 - H+K18; 7 - JanaKal; 8 - K+B; 9 - ?ekeka; 10 - Jarka; 11 - Milučká; 12 - Martina+Katka; 13 - Michaela Petr.

Středa

M - DNA Marker; 1 - Tomáš V; 2 - Kopecká; 3 - Řehulková; 4 - Maruška; 5 - Peter P; 6 - Tobiáš; 7 - Chmelík; 8 - Sukovský; 9 - Scholtzová; 10 - Alena; 11 - Vlaďka; 12 - Ondžej Z; 13 - Novysedlák

Čtvrtek /

Thursday

M - DNA 100bp ladder; 1 - Dora; 2- Nora; 3 - Ani; 4 - Max; 5 - Jordan; 6 - Kartik; 7 - J.O'B; 8-Irina; 9 -Alexi (not shown - no PCR product)

Pátek

M - DNA Marker; 1 - Ďurica; 2 - Šťastná; 3 - Koloděj; 4 - Řehak; 5 - Gašparová; 6 - Toužimská; 7 - Vicenová; 8 - Huťková; 9 - Krupičková; 10 - Michalipesová; 11 - Šatavová; 12 - Vláčil; 13 - Medvecký; 14 - Soběslavská; 15 - Diti

Restrikce amplifikátu s restrikčním enzymem HhaI (rozpoznávajícím sekvenci 5'-GCGC-3')

Restrikční reakce byla prováděna (10. týden) s 5 ul PCR produktu, 1 ul restrikčního pufru a 0.2 ul restrikčního enzymu HhaI (8U/ul) při 37°C přes noc. Na následujícím obrázku je znázorněn fragment exonu 3 genu Apo-E (alela epsilon 4 - viz níže) s vyznačenými pozicemi štěpení restrikčním enzymem HhaI: (Ke stažení zde)

Vysvětlivky k schematu:

Pozice amplifikačních primerů je vyznačena podtrženě, rekogniční (rozpoznávací) místa restrikčního enzymu HhaI jsou v DNA sekveci znázorněna fialově, místa alelických variant, která nás zajímají jsou vyznačena červeně orámovanými žlutými obdélníky (C). Nad sekvencí nukleotidů je uvedena aminokyselinová sekvence v jednopísmenném kódu.

Elektroforéza 10 ul restrikční reakce na 3% agarózovém gelu v 1xTAE pufru (11. týden).

Pondělí

M - DNA Marker; Popis viz PCR; X1 - PCR bez restrikce

Úterý

M - DNA Marker; Popis viz PCR

Středa

Hmm - občas se něco nepovede (vidime nerozštěpené PCR produkty -> asi "kdosi" učinil chybu a nedal do směsi restrikční enzym)

Čtvrtek /

Thursday

M1 - DNA Marker1; M2 - DNA Marker2 (20bp). See PCR result for legend. Missed PCR amplicons were supplied by in-lab PCR product.

Pátek

M - DNA Marker; Popis viz PCR

Nejčastější alelické varianty

V amplifikované části exonu 3 se nacházejí polymorfní lokusy, které mohou nejčastěji vytvářet 3 alely, označované jako epsilon 2, 3 a 4 (viz tabulka níže). Tyto alely jsou charakterizovány záměnou jedné baze v místě nukleotidu 3932 (130 v polypeptidovém řetězci genového produktu APO-E) a/nebo nukleotidu 4070 (176 polypeptidového řetězce APO-E). Ve všech případech se jedná o záměny C za T (nebo naopak) na prvním místě tripletu kódujícího příslušnou aminokyselinu. To znamená, že se v daném místě nachází buď triplet TGC, kodující cytozin (C) nebo triplet CGC, kodující arginin (R).

Alela	Aminokyselina 130	Aminokyselina 176
Epsilon 2	TGC (C)	TGC (C)
Epsilon 3	TGC (C)	CGC (R)
Epsilon 4	CGC (R)	CGC (R)

V populaci se nacházejí jak jedinci homozygotní, tak heterozygoti s kombinací jednotlivých alel. Nejšastější je výskyt homozygotní alely epsilon 3. Vzhledem k tomu, že záměna C za T vede ke změně tripletu kódujícího příslušný aminokyselinový zbytek v polypeptidovém řetězci genu Apo-E, lze předpokládat, že jednotlivé sekvenční/strukturní varianty genu/proteinu mohou mít (a ve skutečnosti mají) dopad na strukturní charakteristiky výsledného proteinu APO-E (záměna Cys za Arg je záměnou hydrofobní aminokyseliny za kladně nabitou, polární aminokyselinu). Tyto změny ovlivňují I funkční charakteristiky proteinu APO-E vrámci metabolizmu lipoproteinů (chylomiker resp. remnantních částic a LDL).

Restrikční analýza

Amplifikovaný úsek genu APO-E se restrikčním enzymem HhaI štěpí v místech polymorfních lokusů podle toho, zda je v konkrétním případě v rekogničním místě baze C nebo T. Výsledkem tohoto štěpení je vznik DNA fragmentů o různých délkách, charakteristických pro různé alely (čísla označují délky fragmentů v bp, červené trojúhelníky restrikční místa):

Kombinací jednotlivých alel u heterozygotů vznikají restrikční fragmenty v délkách uvedených na obrázku níže (silně orámované obdélníky označují dva fragmenty o stejné délce; světležluté obdélníky reprezentují krátké fragmenty, které při horizontální elektroforéze migrují rychle a obvykle vyputují z gelu):

Back