Výsledky z praktických cvičení z molekulární biologie

Izolace genetického materiálu

Izolace DNA z celé periferní krve pomocí izolačního kitu Wizard (Promega).

Elektroforéza 3 ul izolované DNA na 0.7% agarózovém gelu v 1xTAE pufru. M - velikostní DNA standard (Sigma, Broad range DNA marker), 1 - 15 DNA izolovaná v pondělním běhu prakti. U modře označených vzorků je výsledkem izolace standardní vysokomolekulární DNA. Vzorky 3, 7 a 8 jsou k další analýze nevhodné.

Amplifikace DNA (gen Apo-E) pomocí PCR

Sekvenci genu pro lidský apolipoprotein E naleznete zde. Po praktická cvičení byla zvolena metoda podle Kamboh MI et al. Atherosclerosis 1995;112(2):145-59 zde.

Sekvence primerů pro amplifikaci fragmentu exonu 3: P1: 5'-GCGGACATGGAGGACGT-3'; P2: 5'-GGCCTCCTACACTGCCAG-3'

Podmínky PCR reakce: Úvodní denaturace - 95°C 5 min; 30 cyklů: Td=95°C - 30s, Ta=58°C - 60s, Te=72°C - 60s; terminální elongace 72°C - 10min

Elektroforéza PCR produktů na 1.5% agarózovém gelu v 1xTAE pufru.

Pondělí: 1. Ballay, 2. Nováková, 3. Flinta, 3. Terezka, 4. Junasová, 5. Mamgbi, 6. Vataju, 7.Wortschak, 8. Komínek, 9. Káťa, 10. Taan, 11. Dedko, 12. Binová, 13. Norbert, 14. Klm,M - velikostní DNA standard (Sigma, Broad range DNA marker). Modře označené jsou kvalitní PCR produkty použitelné k další analýze.

Středa: 1.Šús+Jar, 2.KMM+OM, 3.B+M, 4.Elma, 5.Ben Soyed, 6.M a A, 7. ZZTOP, 8. T+A, 9.Kubík, 10.Zátop, 11.Hat+Mo+Ma, 12.Lucia+Zuzana, 13.Pája+Gabča+Jája, M. Velikostní DNA standard, 14.LaMiDaRi, 15.Zuzka,Katka,Mirek

Pátek:1. Evča1 2.Evča+Andrea 3. Radka+Viktor+Petra 4. Radka+Andrea 5. Mazel 6. Červení 7. Péťa, Bára, Terka 8. Jana,Lucie,Lucka 9. Eliška,Naelle 10. Zu+Ka 11. Petr,Veronika,Kristýna 12. Jožka, Zuzka 13. Lukáš Lihan 14.Velikostní DNA standard 15. Lucka+Mariola

Restrikce amplifikátu s restrikčním enzymem HhaI (rozpoznávajícím sekvenci 5'-GCGC-3')

Restrikční reakce byla prováděna s 5 ul PCR produktu, 1 ul restrikčního pufru a 0.2 ul restrikčního enzymu HhaI (12U/ul) při 37°C přes noc. Na následujícím obrázku je znázorněn fragment exonu 3 genu Apo-E (alela epsilon 4 - viz níže) s vyznačenými pozicemi štěpení restrikčním enzymem HhaI:

Vysvětlivky k schematu:

Pozice amplifikačních primerů je vyznačena podtrženě, rekogniční (rozpoznávací) místa restrikčního enzymu HhaI jsou v DNA sekveci znázorněna fialově, místa alelických variant, která nás zajímají jsou vyznačena červeně orámovanými žlutými obdélníky (C). Nad sekvencí nukleotidů je uvedena aminokyselinová sekvence v jednopísmenném kódu.

Nejčastější alelické varianty

V amplifikované části exonu 3 se nacházejí polymorfní lokusy, které mohou nejčastěji vytvářet 3 alely, označované jako epsilon 2, 3 a 4 (viz tabulka níže). Tyto alely jsou charakterizovány záměnou jedné baze v místě nukleotidu 3932 (130 v polypeptidovém řetězci genového produktu APO-E) a/nebo nukleotidu 4070 (176 polypeptidového řetězce APO-E). Ve všech případech se jedná o záměny C za T (nebo naopak) na prvním místě tripletu kódujícího příslušnou aminokyselinu. To znamená, že se v daném místě nachází buď triplet TGC, kodující cytozin (C) nebo triplet CGC, kodující arginin (R).

V populaci se nacházejí jak jedinci homozygotní, tak heterozygoti s kombinací jednotlivých alel. Nejšastější je výskyt homozygotní alely epsilon 3. Vzhledem k tomu, že záměna C za T vede ke změně tripletu kódujícího příslušný aminokyselinový zbytek v polypeptidovém řetězci genu Apo-E, lze předpokládat, že jednotlivé sekvenční/strukturní varianty genu/proteinu mohou mít (a ve skutečnosti mají) dopad na strukturní charakteristiky výsledného proteinu APO-E (záměna Cys za Arg je záměnou hydrofobní aminokyseliny za kladně nabitou, polární aminokyselinu). Tyto změny ovlivňují I funkční charakteristiky proteinu APO-E vrámci metabolizmu lipoproteinů. U homozygotních jedinců s výskytem alely epsilon 4 je výrazně zvýšeno riziko vzniku aterosklerózy se zvýšeným výskytem jejích komplikací.

Restrikční analýza

Amplifikovaný úsek genu APO-E se restrikčním enzymem MvaI štěpí v místech polymorfních lokusů podle toho, zda je v konkrétním případě v rekogničním místě baze C nebo T. Výsledkem tohoto štěpení je vznik DNA fragmentů o různých délkách, charakteristických pro různé alely (čísla označují délky fragmentů v bp, červené trojúhelníky restrikční místa):

Kombinací jednotlivých alel u heterozygotů vznikají restrikční fragmenty v délkách uvedených na obrázku níže (silně orámované obdélníky označují dva fragmenty o stejné délce; světležluté obdélníky reprezentují krátké fragmenty, které při horizontální elektroforéze migrují rychle a obvykle vyputují z gelu):

Výsledky restrikčních analýz

Na přiložených obrázcích jsou fotografie polyakrylamidových gelů obarvených ethidiumbromidem. Zastoupení jednotlivých genotypů odečtěte z obrázků srovnáním s DNA velikostními standardy (velikosti jsou uvedeny v bp na posledním obrázku gelu).

Back