1.2 Reflexní fotometrie
      Při této technice se sleduje odražené záření od homogenně zbarvené podložky. Reflexní fotometry se používají pro kvantitativní vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi se suchými činidly po jejich aktivaci vodou obsaženou v měřeném vzorku. Na principu reflexní fotometrie jsou také založeny denzitometry pro kvantitativní hodnocení chromatogramů na tenké vrstvě (viz dále) nebo obarvených elektroforeogramů na neprůhledných nosičích. Matrice pro suchá činidla v systémech tzv. "suché chemie" může být dvojího druhu: buď se jedná o impregnovaná vlákna anebo o vícevrstvý film. Obě skupiny matric vyhodnocujeme reflexní fotometrií, ale přístrojové uspořádání se zásadně liší.

      Proužky z impregnovaných vláken dokonce umožňují vyšetřovat celou řadu analytů z plné krve. Zdrojem světla je světlo emitující dioda nebo několik diod, když je zapotřebí několika vlnových délek, nebo xenonová výbojka (v tom případě je nutno použít vždy vhodný interferenční filtr). Vzhledem k tomu, že světelný výtěžek odraženého světla je poměrně malý, používá se bílý kulový reflektor - Ulbrichtova koule - který fokusuje veškeré odražené světlo z reagenčního políčka impregnovaného vlákna na fotonku.

      Vícevrstvý film představuje na rozdíl od impregnovaných vláken homogenní matrici a reflexní fotometrie prováděná tímto způsobem může při vysoké automatizaci poskytnout výsledky srovnatelné s absorpční fotometrií v roztocích. Zdrojem světla je žárovka s halogenovou atmosférou. Světlo selektované interferenčním filtrem dopadá na film, prochází absorpční vrstvou, odráží se od reflexní podložky, opět prochází absorpční vrstvou a dopadá na fotonásobič. V tomto případě se nepoužívá reflektor (Ulbrichtova koule), ale mnohem citlivější detektor - fotonásobič.

1.3 Plamenová emisní fotometrie
      Při této technice se měří intenzita zbarvení plamene. K emisi záření charakteristické vlnové délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) na původní dráhy. Plamenové fotometry používané v klinické biochemii jsou konstruované zpravidla pro paralelní stanovení koncentrace sodných a draselných iontů v séru nebo moči. Mohou být využity i pro analýzy lithia (monitorování lithných psychofarmak). U běžných plamenových fotometrů je palivem propan, který ve směsi se vzduchem poskytuje teplotu 1930 °C. Některé plamenové fotometry používající palivo acetylen-vzduch mají výhřevnější plamen (2300 °C) a umožňují tak i stanovení vápenatých iontů.

      Roztok analyzovaného vzorku se přivádí do bezbarvého plamene ve formě jemné mlhy, která se vytváří v pneumatickém zmlžovači - atomizéru. K izolaci spektrálních čar se používá interferenčních filtrů a jako detektor intenzity emitovaného světelného toku slouží fotonka. Pro zajištění konstantních podmínek měření se ve všech plamenových fotometrech používá vnitřní standard, kterým je roztok LiCl nebo CsCl a pro stanovení lithia KCl, a který se ve značném množství přidává ke kalibračnímu i zkoumanému roztoku. Vždy se měří současně spektrální linie stanovovaného kovu a kovu vnitřního standardu. Tímto způsobem se kompenzuje vliv změn tlaku plynné směsi a viskozity roztoku.

      V případě vysokých koncentrací bílkovin a lipidů v séru jsou výsledky měření koncentrace iontů plamenovou fotometrií nižší než naměřená aktivita ionselektivními elektrodami, hovoří se např. o pseudohyponatrémii. Je to způsobeno tím, že část objemu rozhodného pro výpočet koncentrace je obsazena bílkovinami a lipidy, takže i když se aktivita ve zbylém vodném objemu nezměnila, bude koncentrace v celkovém objemu nižší.

      Dnes se zdá, že vývoj plamenových fotometrů je už uzavřený a to přesto, že některé přístroje jsou značně automatizované a sofistikované. Plamenový fotometr se obtížně zařazuje do vybavení automatického analyzátoru a vyžaduje dodržování specifických bezpečnostních předpisů. Navíc u pacientů v těžkých stavech (např. při dehydrataci) mohou výsledky, jak bylo výše uvedeno, zkreslovat skutečný stav aktivity iontů v organismu.

1.4 Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS)
      Je to optická metoda založená na měření absorpce elektromagnetického záření v ultrafialové a viditelné části spektra. Atomizace vyžaduje teplotu 2000 až 3000 °K. Volné atomy stanovovaného prvku, v klinické biochemii nejčastěji Ca, Mg a dále Cu, Zn, popřípadě Fe a jiné, absorbují výhradně záření takových vlnových délek, které mohou samy vyzařovat. Paprsek světla vhodné vlnové délky prochází plamenem, do něhož je rozprašován vzorek, nebo je veden přes elektrickou pec (tzv. bezplamenová verze), do které se zavádí vzorek.

      Základní části atomového absorpčního spektrofotometru jsou zdroj záření, absorpční komora, monochromátor a detektor. Zdrojem záření je při stanovení netěkavých kovů dutá katodová výbojka (katoda je z kovu, pro který je lampa určena).

     V plamenové verzi je vzorek rozprašován tryskou do mlžné komory a proudí společně s palivem (acetylén-vzduch) přes hořák do laminárního plamene. Bezplamenové elektrotermické atomizátory pracují ve třech teplotně odlišných krocích: napřed se vzorek z odporově vyhřívané podložky (nejčastěji grafitové) v elektrické peci odpaří, poté se odstraní těkavé látky pyrolýzou a nakonec se provede atomizace.

      K izolaci analyzované spektrální čáry od ostatních čar zdroje záření se používá monochromátor (mřížka) a k detekci fotonásobič. Současné špičkové přístroje umožňují automatickou volbu analyzovaného prvku (včetně všech potřebných analytických parametrů) a vzorky jsou odebírány automaticky z podavače vzorků. V klinické biochemii jsou tato zařízení málo rozšířena, protože jsou nákladná a pokrývají poměrně úzký sortiment vyšetření. Jistý počet těchto přístrojů v oboru je ovšem nezbytný, protože stanovení většiny stopových prvků (zejména Cu a Zn) nelze spolehlivě provést jiným dostupnějším způsobem.

1.5 Fluorimetrie
      Při fluorimetrických stanoveních se využívá jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla (excitační záření) vzniká fotoluminiscence. Látky přitom vyzařují (emitují) světlo, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci fluoreskující sloučeniny. Při excitaci se molekuly dostanou na vyšší energetickou hladinu a při návratu do základního stavu se část energie vyzáří také ve formě tepla. Proto má emitované záření fluoreskujících sloučenin vždy vyšší vlnovou délku (tj. méně energie) než excitační záření, vyvolávající fotoluminiscenci. Fluoreskující sloučeniny jsou často citlivé na malé zněny pH, polarity, na přítomnost oxidačních činidel nebo zhášedel fluorescence.

      Základní konstrukce fluorimetrů sestává ze zdroje zářivé energie, dvou optických separačních prvků a detektoru. Zdrojem záření jsou nejčastěji halogenové žárovky a xenonové výbojky. Světlo ze zdroje prochází buď interferenčním filtrem nebo mřížkovým monochromátorem. Dále prochází kyvetou s roztokem měřeného vzorku a emitovaná fluorescence se měří pod úhlem 90°(při měření v mikrotitračních destičkách je jiné uspořádání), kdy po průchodu filtrem nebo po difrakci reflexní mřížkou dopadá emitované světlo vybrané vlnové délky na fotonásobič.

1.5.1 Fluorescenční polarizace
      Jde o speciální provedení fluorimetrického měření, při němž se k excitaci používá polarizované světlo. Metoda je užitečná zejména při stanovení malých antigenů (např. léků), kdy se využívá rozdílné rychlosti rotace malé molekuly antigenu a velké molekuly imunokomplexu, vzniklé po navázání protilátky. V imunokomplexu je zabrzděna původně volná rotace antigenu. Jestliže je imunokomplex značený fluoreskující látkou, je emitované světlo ve stejné rovině po mnohem delší dobu, než u volného antigenu, neboť u těžkého imunokomplexu se rotace výrazně zpomalila. Toho se využívá v technice fluorescenční polarizace.

      Optické uspořádání je přitom kombinací fluorimetrie a polarimetrie. Halogenová žárovka vyzařuje světelné spektrum s náhodnou prostorovou orientací světla. Filtr propouští modré světlo, které prochází přes polarizační zařízení z tekutého krystalu. Tím se získává rovinně polarizované světlo, které dopadá na kyvetu s měřeným roztokem. Světlo excituje fluorescenční činidlo, vázané na imunokomplex a to pak emituje zelené světlo, které prochází filtrem a dopadá na fotonásobič.

1.6 Chemiluminiscence
      Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se použije biologická substance (enzym luciferáza ze světlušek - chemiluminiscenční varianta se označuje jako bioluminiscence), nebo se k aktivaci činidel využívá oxidace na anodě a technika se nazývá elektrochemiluminiscence.

Pro chemiluminiscenční reakci musí být splněny tři základní požadavky:
1. Při reakci musí vznikat dostatek energie, aby došlo k excitaci elektronů. Proto musí být reakce exotermní a obvykle je to oxidace.
2. Musí existovat způsob jak tuto energii usměrnit do excitace elektronů. Jestliže se chemická energie ztrácí ve formě tepla jako obvykle, pak se chemiluminiscence neobjevuje.
3. Excitovaný produkt musí být schopný ztrácet svoji energii buď ve formě fotonu, nebo ji převádět na fluoreskující sloučeniny. Přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfér energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise.

      Kvantový výtěžek (poměr celkového počtu emitovaných fotonů a celkového počtu zreagovaných molekul) se pohybuje u chemiluminiscence v rozmezí 0.1 až 10%. Citlivost chemiluminiscenčních metod je přesto obvykle významně vyšší než u izotopových metod.

      Přístrojové vybavení pro tuto techniku je pestré: od jednoduchých luminometrů až po vysoce automatizované chemiluminiscenční analyzátory, ve kterých se provádí imunochemické reakce s chemiluminiscenční detekcí. Standardní luminometry se do určité míry podobají fluorimetrům. Před měřicí kyvetou ovšem nemají žádný zdroj světla ani filtr. Uspořádání za kyvetou odpovídá fluorimetrům (filtr, fotonásobič). Téměř všechny luminometry mají také nastřikovací zařízení, protože u zábleskové chemiluminiscence je nutné provést měření ihned po nástřiku reagencií. Některé luminometry měří luminiscenci v mikrotitračních destičkách.

1.7 Turbidimetrie
      Optická metoda založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích se nazývá turbidimetrie. V klinické biochemii je celá řada metod založených na měření stupně zákalu - turbidity - a nejvýznamnější z nich je soubor imunochemických metod, které využívají precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou. Při turbidimetrických měřeních je nejobtížnější získat reprodukovatelně suspenzi měřené reakční směsi, která je dostatečně stálá. K tomu účelu se používají ochranné koloidy (nejčastěji polyetylenglykol).

      Absorpce záření po průchodu nehomogenním prostředím, tj. koloidním roztokem nebo roztokem zakaleným jemnou sraženinou se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry. Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce. Proto se např. specifické proteiny stanovují při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem, tj. při 340 nm v blízké UV oblasti. Do střední UV oblasti nelze dál postupovat, i kdyby to spektrofometr technicky umožňoval, neboť se začne projevovat absorpce nezreagovaných bílkovin, která může hrubě zkreslit měření zákalu imunokomplexu.

1.8 Nefelometrie
      Měřením intenzity difuzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích se zabývá nefelometrie. Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry (tzv. světlo Tyndallovo) a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření.

      Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se Tyndallovo světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry - které mohou být plně automatizovány.

      Laserový nefelometr používá jako světelného zdroje helium-neonového laseru. Tento zdroj monochromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Laserový paprsek prochází přes kyvetu s měřeným roztokem a rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 35° (fotonkou nebo fotonásobičem).

      Konvenční nefelometry používají jako světelných zdrojů žárovku s halogenovou atmosférou nebo xenonovou výbojku. Optika těchto přístrojů obsahuje navíc interferenční filtr, protože světelný zdroj poskytuje polychromatické světlo. Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90°, protože stupeň směrovosti světla z konvenčního zdroje je nízký. Nefelometry mohou měřit také rychlost změny rozptylu světla - kinetiku, která je přímo úměrná rychlosti vzniku imunokomplexu antigen-protilátka.

2. Elektrochemické metody

2.1 Potenciometrie
      Elektrochemická metoda, při které se měří rozdíl potenciálů (napětí) mezi dvěma elektrodami, se nazývá potenciometrie. Jedna z elektrod pracuje jako referenční (srovnávací) a má konstantní potenciál, který nezávisí na složení měřeného roztoku. Druhá elektroda je označována jako indikační (měrná) a její potenciál závisí na aktivitě měřeného analytu ve zkoumaném roztoku. Napětí mezi oběma elektrodami se měří digitálním voltmetrem. Elektrochemické reakce probíhají téměř výhradně na povrchu elektrod. Jde tedy o reakce heterogenní, kde velmi záleží na povrchu elektrod, který musí být dostatečně stálý a reprodukovatelný. Biologické tekutiny jsou složité systémy a obsahují celou řadu povrchově aktivních látek, takže je to technicky dost obtížné.

2.1.1 Iontově selektivní elektrody
      Při použití iontově selektivních elektrod (ISE) rozeznáváme dva typy metod. Nepřímé metody, kde je vzorek vkládán do měřicí komůrky s dosti velkým obsahem diluentu o vysoké iontové síle. Jestliže se měření provádí bez ředění, hovoříme o přímé metodě. V tomto případě lze pracovat i s plnou krví z kapiláry, podobně jako při stanovení parametrů acidobázické regulace.

      V klinické biochemii se používají tři základní konstrukce ISE: ponorné, průtočné a suché elektrodové systémy (slidy). Citlivou membránu tvoří anorganická sůl (např. chloridová elektroda), sklovina (pH elektroda), polymerní matrice nebo iontoměničový roztok, nasáklý do vhodné pórovité struktury (tzv. kapalná membrána). Komerčně dostupné přístroje používají ISE pro stanovení sodných, draselných, lithných, vápenatých, hořečnatých a amonných kationtů a pro oxid uhličitý.

      K měření oxidu uhličitého se používá složená elektroda; jedná se o skleněnou elektrodu, která je od měřeného prostředí oddělena membránou propouštějící CO₂. Difuzí oxidu uhličitého do tohoto prostředí vzniká ve vodném prostředí disociovaná kyselina uhličitá a množství vzniklých protonů je stanoveno pH elektrodou. Jako referenční elektroda je téměř ve všech případech používána Ag/AgCl elektroda. Všechny ISE jsou elektrody s velkým odporem a přesnost jejich měření závisí na citlivosti voltmetru.

      Při stanovení v moči se musí vzorky vždy ředit diluentem s velkou iontovou silou, aby se kompenzoval vliv kolísání iontové síly v samotném vzorku moče. Současné ISE analyzátory jsou vybaveny podavačem vzorků, dokonalým proplachovacím zařízením a možností automatické rekalibrace.

2.1.2 Enzymové elektrody
      Podstatou konstrukce enzymových elektrod je předřazení membrány s imobilizovaným enzymem (např. ureázou pro stanovení močoviny nebo glukózaoxidázou pro stanovení glukózy) před vlastní elektrochemické čidlo. Stanovovaný substrát difunduje do enzymové membrány, kde reaguje s imobilizovaným enzymem na produkt, který se pak deteguje potenciometricky nebo ampérometricky.

2.2. Polarografie
      Při této elektrochemické metodě měříme intenzitu proudu ampérometricky při konstantním vnějším napětí (potenciálu). Na tomto principu je založena Clarkova elektroda, která slouží ke stanovení množství kyslíku. Kyslík rozpuštěný ve vzorku nebo v pufru difunduje přes hydrofobní membránu propustnou pro plyny ke katodě, která je obvykle z platiny. Zde se při konstantním vnějším potenciálu - přepětí - redukuje na vodu podle rovnice:

     Jako anoda slouží Ag/AgCl elektroda. V klinické biochemii se s Clarkovou elektrodou setkáváme nejčastěji u acidobázických analyzátorů, kde se používá k měření parciálního tlaku kyslíku a v některých analyzátorech glukózy, kde se touto elektrodou sleduje úbytek kyslíku v glukózaoxidázové reakci.

2.3 Coulometrie
      Je to analytická metoda, v níž se ke stanovení koncentrace látky v roztoku používá měření prošlého náboje při elektrochemické reakci. V naší praxi se používá coulometrie za konstantního proudu - ampérostatická coulometrie, běžně nazývaná coulometrická titrace. Tento postup se používá pouze ke stanovení chloridů. Stanovovaná látka reaguje s činidlem vzniklým na jedné z elektrod ve vhodném elektrolytu. Reakce musí probíhat se 100 % proudovým výtěžkem a činidlo musí reagovat rychle. Např. stříbrná anoda vyvíjí Ag⁺ ionty, které s chloridovými ionty vytvářejí sraženinu AgCl. Referenční elektroda je merkuro-sulfátová. Konec titrace (tj. vysrážení všech chloridových iontů) se indikuje potenciometricky dalšími dvěma elektrodami.

Podle délky titrace (t) se při konstantním proudu (I) určí náboj (Q) dle vztahu Q = I . t a tomu odpovídající množství titrované látky.

2.4 Konduktometrie
      Elektrochemická metoda založená na měření vodivosti analyzovaného roztoku se nazývá konduktometrie. Elektrická vodivost roztoku závisí na koncentraci iontů, jejich pohyblivosti, disociaci a teplotě roztoku. K měření se používají dvě platinové elektrody, mezi kterými se měří vodivost.

      Přístroje pro měření vodivosti, konduktometry, se používají zejména ke sledování čistoty destilované a deionizované vody. Na tomto principu jsou založeny také impendanční elektrody pro stanovení hematokritu a konduktometrický princip se často používá v hematologii u počítačů krvinek.

3. Elektroforetické metody

      Elektroforéza je analytická metoda založená na rozdílné pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul, jakož i na vlastnostech prostředí.

3.1 Zónová elektroforéza
      Jde o nejrozšířenější elektroforetickou metodu. Využívá jako nosiče acetylcelulózu, nebo různé gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový). Pro kvalitu separace jsou rozhodující:
- homogenita a velikost elektrického pole
- homogenita a velikost pórů nosiče a jeho fyzikálně-chemické vlastnosti,
- pH pufru, jeho iontová síla a případné interakce se vzorkem.

Při dělení na acetylcelulózových fóliích dochází k distribuci převážně podle velikosti náboje. K dělení se v elektroforetické vaně používá napětí 10 - 30 V/cm, intenzita proudu do 0,3 až 0,5 mA/cm a elektroforéza trvá 15 - 30 minut. Po ukončení dělení se jednotlivé složky fixují a barví. Pak se fólie odbarví, příp. zprůsvitní a vysuší. Při práci s agarem (směs polysacharidů agarózy a agaropektinu) anebo s purifikovanou agarózou se postupuje podobně. Použití agaru má relativní nevýhodu v tom, že jeho vlákna obsahují řadu fixních disociovatelných skupin, které za alkalického pH nesou negatívní náboj. To se projevuje elektroendoosmózou, tedy tokem pufru směrem ke katodě, tj. proti směru dělení např. většiny sérových bílkovin. To může při elektroforéze dokonce vyvolat zpětný pohyb některých frakcí, takže místo k anodě se "pohybují" ke katodě.

      Při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu (PAGE) se látky dělí nejen na základě elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul. Efekt molekulového síta se zesílí v polyakrylamidovém gelu s gradientem hustoty. V tomto uspořádání se ve směru pohybu dělených látek zvyšuje koncentrace akrylamidu, a tím se zmenšuje při polymeraci velikost ok sítě. V místech zastavení pohybufrakce se vytvoří linie, aprotose tento typ elektroforézy nazývá disková. Rozlišovací schopnost tohoto typu elektroforézy je mnohem vyšší než u předchozích nosičů. Jestliže se k polyakrylamidovému gelu přidá laurylsíran sodný (dodecylsulfát sodný, SDS), mají všechny molekuly téměř stejný elektrický náboj a dělí se jen podle velikosti svých molekul.

      Vyhodnocení obarvených elektroforeogramů se provádí na densitometru tak, že se elektroforeogram automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (z žárovky s halogenovou atmosférou, světlo emitující diody nebo výjimečně i laseru). V místě frakcí dochází k částečné absorpci záření. To se projeví při jeho dopadu na čidlo (fotonku, fotonásobič) a převodu signálu na analogový záznam elektroforeogramu. Po zpracování integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí. Tento způsob je častý při rutinních elektroforézách sérových bílkovin, kdy na jedné podložce může být současně i několik desítek elektroforeogramů. Po ukončení snímání prvního elektroforeogramu se měřená deska automaticky posune a může se vyhodnocovat další dráha.

3.2 Izoelektrická fokusace
      Od předchozích technik se izoelektrická fokusace liší tím, že dělení probíhá v gradientu pH, který se mění rovnoměrně od kyselé do alkalické oblasti (u anody je pH nejnižší a směrem ke katodě roste). Gradientu se dosahuje pomocí amfolytů, tj. elektrolytů, obsahujících směsi organických látek se skupinami -NH₂ a -COOH), které se ve stejnosměrném elektrickém poli seřadí podle velikosti svého izoelektrického bodu (pI) a vytvoří tak gradient pH. Izoelektrický bod je hodnota pH, při níž je pro danou látku vyvážen počet kladných a záporných nábojů, takže se molekula jeví navenek jako elektroneutrální.

      Při izoelektrické fokusaci je nosičem agarózový nebo polyakrylamidový gel. Metoda se používá zejména pro dělení izoenzymů. Předností je vysoká ostrost dělení (rozlišovací schopnost), nevýhodou je pak vyšší cena amfolytových pufrů a zdlouhavost metody.

3.3 Izotachoforéza
      Je to analytická metoda pro dělení kationtů a aniontů ve stejnosměrném elektrickém poli podle jejich rozdílných pohyblivostí. U izotachoforézy je vzorek umístěn mezi dva různé elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů. Na čele se pohybuje vedoucí elektrolyt, který musí mít větší pohyblivost než kterýkoliv z kationtů resp. aniontů (podle typu izotachoforézy) obsažených ve vzorku. Na konci kapiláry je koncový elektrolyt, který má menší pohyblivost než kterýkoliv z kationtů resp. aniontů (podle typu izotachoforézy) obsažených ve vzorku. Všechny ionty se pak kapilárou pohybují stejnou rychlostí k opačně nabitým elektrodám, avšak budou seřazeny podle svých pohyblivostí. Po určité době jednotlivé složky vytvářejí ostře oddělené zóny seřazené těsně za sebou. To, že se pomalejší ionty pohybují stejně rychle jako ionty pohyblivější je možné díky tomu, že v každé zóně je jiný gradient potenciálu, který je nepřímo úměrný vodivosti roztoku v zóně. Na konci kapiláry je umístěné čidlo detektoru, které měří vodivost nebo absorpci UV světla dané vrstvy. Naměřený signál se pak převede na analogový zapisovač a může být vyjádřen také v číselné formě. Při izotachoforéze pracujeme s vysokým napětím (až 35 kV).

      Předností izotachoforézy je rychlost provedení (někdy postačují 4 minuty) a ostrost dělení. Tímto způsobem lze stanovit několik aniontů (nebo kationtů) současně. V klinické biochemii se tímto způsobem stanovují hlavně anionty (laktát, pyruvát, ketokyseliny aj.)

3.4 Kapilární elektroforéza
      Provádí se v tenkých skleněných kapilárách (světlost 0,1 mm) dlouhých až 1 m, které mohou být plněny polyakrylamidovým gelem (PAA) nebo analytickým pufrem. Při práci s PAA je princip dělení stejný jako u zónové elektroforézy. V případě použití analytického pufru se obvykle používá fosfátový pufr a vyšší napětí. Detekce frakce se na rozdíl od zónové elektroforézy provádí UV absorpčním detektorem nebo detektorem diodového pole.

      Kapilární elektroforéza je rychlá, má vysokou rozlišovací schopnost a nízkou spotřebu vzorku. Stupeň automatizace je značný, součástí zařízení může být automatické dávkování, několikanásobný nástřik, výměna nebo doplnění pufru, změna polarity, program napětí a tlaku a sběr frakcí. V klinické biochemii se kapilární elektroforéza používá dosud omezeně, hlavně při diagnostice metabolických poruch a subfrakcí imunoglobulinů.

4. Fyzikální metody

4.1 Osmometrie
     Tlak rozpuštěných, zejména nízkomolekulárních látek a iontů v roztoku odděleném polopropustnou membránou od samotného rozpouštědla se nazývá osmotický tlak. Osmotický tlak je přímo úměrný celkovému počtu rozpuštěných nebo disociovaných částic. Pokud látka disociuje, je každá její disociovaná část osmoticky aktivní částicí. Nedisociovaná látka představuje jen jednu osmoticky aktivní částici. Látková koncentrace osmoticky aktivních částic v 1 kg rozpouštědla se označuje jako osmolalita (mmol/kg). Měření osmolality se nazývá osmometrie.

      V laboratorní práci se používá nepřímé měření osmotického tlaku. Vychází se z měření těch vlastností roztoků, které se mění v závislosti na změně osmolality. V klinické biochemii se používají dva typy osmometrů. První typ využívá snížení teploty tuhnutí roztoku v závislosti na koncentraci částic v roztoku (kryoskopie). Osmometry musí být vybaveny velmi citlivým teploměrem (s rozlišitelností tisíciny °C), protože snížení teploty tuhnutí je velmi malé (přibližně o 0,5 °C v séru). Druhý typ sleduje snížení tenze par rozpouštědla nad roztokem (zvýšení teploty varu, ebulioskopie), resp. snížení rosného bodu par nad roztokem v závislosti na koncentraci částic v roztoku pomocí termoelektrického hygrometru. Osmometry mohou být vybaveny podavačem vzorků a automatizovány.

      Rozhodující pro osmolalitu biologického vzorku je koncentrace sodných iontů, močoviny a glukózy. V případě, že není k dispozici osmometr, lze osmolalitu orientačně vypočítat takto (viz též kapitola 2).

Údaje v hranatých závorkách jsou látkové koncentrace v mmol/l.

4.2 Onkometrie
      Koloidně osmotický tlak plazmatických bílkovin se nazývá onkotický tlak. K měření se používá polopropustná membrána, která odděluje tekutiny o různé koncentraci vysokomolekulárních látek. Principem měření onkotického tlaku onkometrem je sledování rozdílu tlaku mezi referenční komůrkou a komůrkou s měřeným vzorkem, které jsou oddělené polopropustnou membránou, pomocí indikátoru tlaku. Výstupní signál z indikátoru tlaku je zesílen a převeden na základě kalibrace přímo na jednotky tlaku [kPa]. Onkometry se v klinické biochemii používají vzácně a většinou bývají součástí přístrojové výbavy jednotek intenzívní péče a ARO.

5. Izotopové metody

5.1 Scintilační systémy
      Při některých imunochemických technikách se používá značení reaktantů atomy tricia (³H). Výhodou tohoto značení je skutečnost, že se jen velmi málo změní hmotnost molekuly a její vlastnosti. Nevýhodou je nutnost používání speciálních scintilačních počítačů. Tricium totiž vyzařuje pouze měkké beta-záření, které neprochází stěnou zkumavky a proto je nutné tyto analytické reakce provádět s příměsí organických látek obsahujících 3 až 4 aromatické kruhy, tzv. scintilátorů. Působením beta záření (tj. elektronů) tyto látky vyzařují fotony a mohou být již detegovány fotonásobičem. Scintilační počítače se používají v klinické biochemii zcela výjimečně.

5.2 Využití gama-záření
      Při těchto metodách se používá značení ¹²⁵I, což je gama-zářič, tedy zdroj tvrdého záření. Radioimunoanalýza a imunoradiometrie byly první moderní imunochemické metody, které využily tohoto radionuklidu a jsou dosud v klinické biochemii velmi rozšířeny. Při radioimunoanalýze (RIA) se značí antigen, který se přidává do reakce a soutěží se stanovovaným antigenem o omezený počet míst na protilátce. Při metodě imunoradiometrické (IRMA) je značená protilátka. Jde o nekompetitivní metodu, kdy se na kotvící protilátku (na pevné fázi) naváže stanovovaný antigen a pak se přidává druhá protilátka (značená ¹²⁵I) v nadbytku. Tento typ metod se označuje jako sendvičové.

Citlivost obou metod závisí na:
      a) afinitě protilátky k měřenému antigenu
      b) molekulové hmotnosti značkovadla a protilátky
      c) objemu inkubačního média
      d) přesnosti analýzy.

Pro měření gama-záření se používají vícekanálové gama-měřiče (gama-počítače), schopné analyzovat současně více vzorků. Radioaktivita se měří jako počet impulzů za minutu. Detekční systém je založen na bázi krystalů NaI, které jsou kompaktně spojené s fotonásobičem a celý detektor je umístěný v olověném stínítku. Pipetování vzorků, imunochemická reakce, promývání (separace imunokomplexu a volných reaktantů) a měření radioaktivity mohou být plně automatizovány.

6. Chromatografické metody

6.1. Chromatografie na tenkých vrstvách (TLC)
      Při těchto postupech se využívá principu rozdělovací, adsorpční, ionexové (výměna iontů) i afinitní (specifická vazba látek na ligand, navázaný na nosič) chromatografie. Před plotnami připravovanými v laboratoři se dnes dává přednost průmyslově vyráběným hliníkovým fóliím s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým. Vzorky se nanášejí pipetou a vyvíjejí se v chromatografické vaně (komoře) v soustavě rozpouštědel. Je možné použít i dvourozměrné tenkovrstevné techniky, kdy se chromatogram po doběhnutí čela rozpouštědla na konec desky vysuší, deska se otočí o 90° a provede se chromatografie v kolmém směru s jinou soustavou rozpouštědel.

      Detekce může být destruktivní (reakce s H₂SO₄, KMnO₄, K₂Cr₂O₇) nebo nedestruktivní (UV světlo, přechodná absorpce par jódu). V současné době se také používá výraz "vysoce účinná chromatografie na tenkých vrstvách" (HPTLC) pro komerční desky s velmi tenkou vrstvou silikagelu s malou velikostí částic (do 10 µm), které umožňují podstatně účinnější dělení. V klinické biochemii se chromatografie na tenkých vrstvách používá méně než v minulosti a spíše se dává přednost exaktnějším chromatografickým metodám.

6.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie
      Při kapalinové chromatografii se látky dělí ve dvoufázovém dělicím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou kapalnou stacionární fází, nebo na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta. Celý děj se odehrává ve speciálně konstruovaných trubicích, nazývaných kolony. Účinnost všech typů chromatografických kolon se hodnotí podle počtu teoretických pater, které odpovídají výkonem zhruba patrům destilační kolony. Čím je větší počet pater, tím je kolona účinnější. Účinnost chromatografických kolon je obrovská, dosahuje i několika set tisíc teoretických pater. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) pracuje s úzkými ocelovými, skleněnými nebo křemennými kolonami, které obsahují nosné částice (<10 µm) se stacionární fází. Průtok mobilní fáze neprobíhá účinkem gravitace jako u klasické kapalinové chromatografie, ale obvykle pod určitým tlakem. Někdy postačuje 1 MPa, skleněné kolony vydrží až 30 MPa, ale čerpadla mohou vyvinout tlak kolem 100 MPa. Častěji se používá nízkotlaká HPLC (několik MPa) než vysokotlaká HPLC (desítky MPa).

      Při dávkování vzorku do kapalinového chromatografu lze v případě nízkotlaké verze použít přímý nástřik na kolonu přes elastickou membránu. Vysokotlaká HPLC vyžaduje použít speciální ventil s dávkovací smyčkou. Vícecestný ventil umožňuje nástřik do smyčky a současně jinou cestou prochází mobilní fáze ze zásobníku do kolony. Po přepnutí ventilu se vytlačí vzorek mobilní fází ze smyčky na kolonu.

      Na koloně se látky rozdělují zpravidla eluční metodou. Kolony mohou být také mírně vyhřívány, ale zpravidla se ohřev nepoužívá. Na výstupu z kolony je připojen detektor UV-VIS, fluorimetrický, detektor diodového pole, popřípadě elektrochemický, kde se sleduje coulometricky oxidoredukční reakce stanovovaných látek na pracovní elektrodě. Získaný signál jde na analogový zapisovač a je číselně vyhodnocen integrátorem. Jako detektor lze také použít hmotnostní spektometr, což je analyticky vynikající, ale technicky i finančně velmi náročné řešení, protože je nutné propojit vysokotlakou HPLC část s hmotnostním spektrometrem, kde je naopak vysoké vakuum.
      Významnou částí kapalinového chromatografu jsou čerpadla. Moderní přístroje využívají obvykle dvě pulzní pístová čerpadla, jejichž činnost je fázově posunuta a pohybují se tak, aby došlo k maximálnímu potlačení pulzace toku mobilní fáze.
      Mobilní fáze může mít konstantní polaritu, kdy čerpadlo pumpuje do kolony jediné rozpouštědlo (např. metanol). Tento režim, který se nazývá izokratický, se používá nejčastěji. Je také možné měnit eluční sílu mobilní fáze tak, že se postupně mění zastoupení dvou nebo více rozpouštědel. Tuto gradientovou eluci lze provést jak v nízkotlaké, tak ve vysokotlaké variantě. Stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze jue polární. Nejrychleji se tedy eluují nejvíce polární sloučeniny.Toto uspořádání se nazývá reverzní (obrácené) fáze. Název reverzní má historickou podstatu: v začátcích HPLC byla stacionární fáze polárnější než mobilní, dnes je to obráceně - proto reverzní (obrácené) fáze.
      HPLC má v klinické biochemii podobné využití jako plynová chromatografie, ale navíc lze tuto metodu aplikovat i při stanovení termolabilních látek, např. enzymů. Existují plně automatizované HPLC systémy schopné nepřetržitého provozu, kde lze udělat i několik set analýz za 24 hodin.

6.3 Plynová chromatografie
      Je to fyzikálně chemická metoda, při které dochází k dělení směsi látek na základě distribuce mezi mobilní (pohyblivou) a stacionární (zakotvenou) fází. Mobilní fází je plyn, stacionární fází může být pevná látka a metoda se označuje jako adsorpční plynová chromatografie, nebo kapalina, a pak se jedná o rozdělovací plynovou chromatografii. Těmito technikami můžeme dělit všechny látky, které lze po zahřátí kolony na pracovní teplotu (až 400 °C) převést bez rozkladu na plynnou fázi. U látek s vysokou teplotou varu se provede derivatizace, tj. reakce, jejímž výsledkem jsou deriváty původní sloučeniny s nižší teplotou varu. Pevné vzorky se předem rozpustí v těkavých kapalinách.

      Dělení probíhá v plynovém chromatografu. Vzorky se nastřikují do vyhřívaného dávkovače přes plynotěsnou elastickou membránu velmi přesnou stříkačkou. Pak dochází ke zplynění vzorku a jeho páry jsou nosným plynem, jímž je zpravidla dusík nebo argon, unášeny do vyhřívané kolony. Používají se kolony náplňové nebo kapilární. Při průchodu kolonou se jednotlivé látky dělí na principu adsorpční nebo rozdělovací chromatografie. Po rozdělení procházejí separované sloučeniny detektorem. Detektor pracuje na principu plamenoionizačním, kde se rozdělené složky zavádějí do plamene vodík-vzduch a sleduje se jejich ionizace, nebo se jedná o detektor elektronového záchytu, kde dochází k záchytu elektronů z beta-zářiče eletronegativními atomy stanovované látky a tím ke snížení měřeného ionizačního proudu. Signál jde na analogový zapisovač a integrátorem je zpracován na číselný výstup.

      Pro stanovení jednotlivých složek separovaných plynovou chromatografií lze použít také hmotnostního spektrometru. Tento způsob detekce nabízejí špičkové plynové chromatografy. V iontovém zdroji hmotnostního spektrometru při vysokém vakuu dostávají molekuly pozitivní náboj. Pak procházejí elektrickým polem, kde se jednotlivé fragmenty i molekulový kation urychlují podle velikosti náboje a kolmo působícím magnetickým polem, kde se vychylují podle své hmotnosti a dopadají na detektor (počítač částic). Tak vzniká hmotnostní spektrum, které charakterizuje nejen kvantitativní zastoupení látek, ale také velmi spolehlivě vypovídá o jejich kvalitě (tj. o jakou sloučeninu se jedná).

      V klinické biochemii se plynová chromatografie používá zejména při stanovení léčiv a jejich metabolitů, a dále pro stanovení alkoholu, organických kyselin, hormonů a steroidů.

7. Automatické analyzátory

7.1. Univerzální automatické analyzátory
      Rozhodující část rutinních analýz v klinicko-biochemických laboratořích (asi 80 %) provádějí automatické analyzátory. Jedná se o zařízení, která umožňují automatické zpracování vzorku, měření signálu a zpracování získaných dat. Automatický analyzátor je nejvýkonnější analytický přístroj v laboratoři. Univerzální analyzátory umožňují pracovat se standardně používanými reagenciemi různých firem. V současné době se používají zejména diskrétní analyzátory, kde jsou analytické reakce pro každý typ vyšetření prováděny v separátní zkumavce. Jen výjimečně se měří dvě různé reakce současně při dvou rozdílných vlnových délkách. Reakční zkumavka může být zároveň použita jako měřicí kyveta. Separátní měřicí kyveta, do které se postupně čerpají předem připravené reakční směsi, se vyskytuje jen u nejmenších analyzátorů většinou staršího typu, protože toto uspořádání zpomaluje analytický proces, zejména při kinetických měřeních. Vzorky jsou umístěny ve zkumavkách nebo "kepech", malých kónických zkumavkách (z anglického "cup" = šálek, kalíšek) umístěných na otočných talířích, v posuvných stojanech nebo v řetězových unašečích. Kepy a přesné nastavení pipetorů umožňují, aby mrtvý tj. nepoužitelný objem vzorku byl malý (10 až 50 µl).

      Analyzátory jsou selektivní a vykonávají z každého vzorku pouze požadované testy. Reagencie jsou v jednom nebo ve dvou zásobnících, které jsou kruhové otočné, ale mohou být i obdélníkové nebo jiného tvaru. U analyzátorů střední a vyšší cenové kategorie je alespoň část prostoru s reagenciemi chlazena a chlazen může být také zásobník vzorků.

      Běžná spotřeba vzorku (sérum, plazma, moč, likvor) obvykle nepřesahuje 5 µl (obvyklý rozsah je 1 až 30 µl) a celková spotřeba reagencií nepřesahuje 250 µl (obvyklý rozsah je 100 až 500 µl). Zpravidla je možné přidávat k napipetovanému vzorku dvě reagencie (1 až 4 reagencie). Moderní analyzátory používají identifikaci vzorků a činidel pomocí čárového kódu (bar code). Vložit urgentní vzorek (STATIM) nebo změnit prioritu již objednaného vzorku umožňují moderní analyzátory v kterémkoliv okamžiku provozu.

      Univerzální automatický analyzátor je vždy vybaven pipetovací stanicí, kde je jeden nebo více pipetorů. Pipetování je jedním z rozhodujících kroků přesné a správné analýzy. Proto se zpravidla vzorek a činidlo z pipety vypláchne deionizovanou vodou. Pipety jsou oplachovány také zevně a jejich povrch bývá nesmáčivý. Po napipetování každého činidla se reakční směs zamíchá vnější rotací, vibrací, ultrazvukem nebo zevnitř míchadlem. Provede se inkubace reakční směsi při 37 °C (výjimečně při jiné teplotě) a následuje měření ve fotometrické části.

      Zdrojem světla je nejčastěji wolframová žárovka s halogenovou atmosférou, případně xenonová nebo rtuťová výbojka. Světlo zvolené vlnové délky získané interferenčním filtrem dopadá na zkumavku (kyvetu) a část je absorbována měřeným roztokem. Zbytek dopadá na fotonku a získaný signál je upraven a vyhodnocen. Jinou možností je nepoužít filtr, ale prošlé světlo rozložit mřížkou a nechat dopadnout na zjednodušený detektor diodového pole, který má 16 diod (standardní HPLC detektor diodového pole má více než 200 diod).

      Univerzální analyzátory mohou být stolní přístroje, ale také mohou sestávat z několika rozměrných modulů. Rychlost analýzy se pohybuje od několika desítek analýz/h do několika tisíc analýz/h (tyto vysoce kapacitní přístroje v ČR nejsou).

      Jestliže jsou výsledky mimo zadané rozmezí, mohou být automaticky opakovány v odlišném poměru vzorku a činidla tak, aby naměřená absorbance odpovídala hodnotám kalibrační křivky. Součástí univerzálního analyzátoru může být ISE modul pro stanovení aktivity sodných, draselných a popřípadě chloridových iontů. Ionselektivní elektrody a pomocné roztoky pro tento modul mohou být používány jen od výrobce analyzátoru.

      Software analyzátoru bývá vybaven diagnostikou chyb a v případě závažné poruchy se provoz automaticky zastaví a ohlásí se závada nebo se spustí zvukový alarm. Analyzátory mají také zpravidla obousměrné rozhraní (interace) pro připojení analyzátoru na nadřazený počítač, na laboratorní řídicí a informační systém nebo na nemocniční informační síť.

7.2 Speciální automatické analyzátory
      Jsou to automatické analytické systémy schopné pracovat pouze s reagenčními soupravami výrobce analyzátoru. Do této kategorie patří elektrochemické analyzátory používající ionselektivní, enzymové, polarografické a impendanční elektrody, analyzátory na principu reflexní fotometrie (měření na analytických filmech) a především imunochemické analyzátory.

      Imunochemické analyzátory se liší od standardních univerzálních analyzátorů tím, že jsou zpravidla určeny k automatizaci heterogenní imunoanalýzy. Jsou totiž schopné provést separační krok (jeden nebo více) a oddělit tím navázaný imunokomplex na stěně zkumavky, mikrotitrační destičky, frity, na kuličkách, na mikrokuličkách nebo na magnetickýcch zrnech od volných reaktantů. Separace se děje tak, že se pevná fáze s navázaným imunokomplexem propláchne a volné reaktanty se odsají nebo odfiltrují. Pak se provádí detekce enzymového markeru fotometru, fluorimetricky nebo chemiluminometricky. Analyzátory provádějící fluorescenční a chemiluminiscenční detekci používají citlivější detektor než ostatní analyzátory, tj. fotonásobič (viz výše část 1.5 a 1.6).

      U imunochemických analyzátorů je pro úspěch analýzy důležitější kvalita reagencií a technologie provedení imunochemické reakce než důmyslnost automatického analyzátoru. Existují i univerzální imunochemické analyzátory, ale možnosti pro ně nejsou tak široké. Většina výrobců nabízí reagencie použitelné pouze pro své přístroje a obvykle s nimi dosahuje lepších výsledků, než se dosahuje s volně použitelnými imunoreagenciemi na univerzálních imunochemických analyzátorech.

      Závěrem je třeba připomenout, že do kategorie imunochemických analyzátorů se také počítají nefelometrické analyzátory, které nepotřebují provádět (a ani neumí) separační krok.

8.Doporučená literatura:

I. BILYK, R. NEMEC: Vybrané laboratorní metody. Avicenum,zdrav.nakladatelství Praha 1988
H. KELLER: Klinisch-chemische Labordiagnostik für die Praxis. Analyse, Befund, Interpretation. G. Thieme Verlag Stuttgart, New York 1991
O. SONNTAG: Dry chemistry. Analysis with carrier-bound reagents. Elsevier Amsterdam, London, N. York, Tokyo 1993
D.P. STITES, A.I. TERR: Základní a klinická imunologie. Victoria Publishing a.s. Praha 1994
S.C. ANDERSON, S. COCKAYNE: Clinical chemistry. Concepts and Applications. W.B. Saunders Co., Harcourt Brace Jovanovich Inc. Philadelphia 1993
M. KODÍČEK, V. KARPENKO: Biofyzikální chemie. Učební text Fakulty potravinářské a biochemické technologie VŠCHT Praha. Vydavatelství VŠCHT Praha 1997