Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK Laboratoř gastroenterologie zveřejňuje na této stránce aktuální nabídky, nově zavedené laboratorní vyšetření a další aktuality z oboru gastroenterologie. Podrobné údaje o laboratorních testech pro gastroenterologii najdete v naší on-line internetové miniencyklopedii - GastroLab s odkazy na Národní číselník laboratorních položek (na webu MZ ČR) a abstrakta z databáze NLM Medline.

Název metodiky	Kód národního číselníku SLP	Normální hodnoty
Dechový test 13C - Helicobacter pylori	D_HP_D	0-4 ‰
Dechový test 13C - Pankreatická funkce	D_MTG_D	> 30 %
Dechový test 13C - Funkce tenkého střeva	D_XYL_D	0-5 ‰
Pankreatická elastáza v séru - ELISA	S_PELA_ELISA	0-3,5 ng/l
Pankreatická elastáza ve stolici - ELISA	F_PELA_ELISA	> 200 ug/g
Pepsinogen I a II - ELISA	S_PEPS_ELISA	30-120 ug/l
Kvantitativní test Hb ve stolici	F_HB_OK	0-100 ng/ml
Helicobacter pylori antigen ve stolici	F_HPAG	negativní

Lidská pankreatická elastáza 1
je syntetizována acinárními buňkami pankreatu. Enzym je secernován pankreatickou šťávou do duodena a během střevní pasáže není degradována proteinová sekvence zvolená pro immunochemickou detekci. Stanovení elastázy vykazuje proto vyšší dg. přínos, na rozdíl od chromogenní metody stanovení chymotrypsinu ve stolici. Aktivita lidské pankreatické elastázy 1 ve vzorcích stolice odráží míru exokrinní pankreatické funkce. Při zánětlivých procesech dochází také k retrográdnímu uvolnění do krevního oběhu a kvantifikace sérové hladiny lidské pankreatické elastázy je vhodným markerem akutní pankreatitidy a karcinomu pankreatu.
Metodika stanovení:
Gastroenterologická laboratoř používá soupravu ScheBoTech (Německo) www.schebo.com . ELISA technika na mikrotitračních destičkách pro 96 vzorků ve stripovém uspořádání (6x16 vzorků). Specificita soupravy je determinována monoklonální protilátkou k lidské pankreatické elastáze 1, detekční systém je založen na POD-streptavidin značené protilátce a reakci s ABTS [2, 2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) diammonium salt] substrátem. Citlivost metodiky je 0,5 ng/ml séra.

Výhody stanovení EL-1:
- EL-1 ELISA test je absolutně pankreas-specifickým
- stabilita během střevní pasáže umožňuje použití jako funkčního testu
- medikamentózní substituční terapie neovlivňuje výsledek testu
Referenční hodnoty v séru: < 3.5 ng/ml séra
Funkční test (stolice): normální hodnoty od 200 do >500 ug EL-1/g stolice, lehká a střední insufficience pankreatu 100 - 200 ug EL-1/g stolice , těžká insufficience pankreatu < 100 ug EL-1/g stolice.

Vyšetření okultního krvácení ve stolici je provedeno kvantitativním stanovením lidského hemoglobinu. Metoda stanovuje hemoglobin latexovou reakcí s polyklonální protilátkou k Hb A0 IgG. Analýza je provedena na automatickém analyzátoru firmy Eiken (Japonsko) - OC Senzor Mikro. Odběrový systém pro stolici zajišťuje kvantitativní aspekt odběru stolice na 10 mg vzorku, extrakci stolice ve 2 ml stabilizujícího pufru, filtraci analytu a přímý odběr extraktu do reakční kyvety analyzátoru. Odběrové nádobky jsou identifikovány čárovým kódem.

Podrobný návod pro pacienta, jak odebrat vzorky pomocí odběrového systému Eiken je zde ke stažení - PDF dokument - qi-fobt.pdf. Edukační - eLearningový text s obrázky je zveřejněn na Výukovém portálu 1.LF UK - Stanovení okultního krvácení.

Vlastní provedení testu: (kliknutím na obrázek je lze zvětšit)
1. Na odběrovou nádobku napište své jméno a datum odběru
2. Opatrně odšroubujte zelený uzávěr odběrové nádobky otočením doleva, a vysuňte odběrový kartáček.
3. Vlastní odběr vzorku stolice proveďte opakovaným seškrábnutím povrchu stolice, na obě strany, tak aby odběrový kartáček byl zaplněn vzorkem stolice.
4. Opatrně vložte aplikátor - kartáček - přímo do plastové lahvičky, neotáčet, zasunout a mírným tlakem uzavřít.
5. Odběrovou nádobku uložte do chladničky a přineste do laboratoře k vyhodnocení.

Literatura:
Kovářová J.T., Zavoral M., Zima T., Žák A., Kocna P., Kohout P., Granátová J., Vaníčková Z., Vránová J., Suchánek S., Beneš Z., Čelko M.A., Povýšil C.: Improvements in colorectal cancer screening programmes – quantitative immunochemical faecal occult blood testing – how to set the cut-off for a particular population. Biomed Pap 2012, 156 (2): 143 - 150 , on-line web free PDF Full text
Kocna P., Zima T.: Kvantitativní imunochemické testy detekce krve ve stolici pro screening kolorektálních tumorů. FONS Bulletin, 2012, 3: 4 - 7, on-line web free PDF Full text
Kocna, P.: Kvantitativní test okultního krvácení ve stolici. MedicalMedia 2012: on-line video: www.medicalmedia.eu/detail.aspx?lang=cz&ID=153

Sérový pepsinogen-I patří do skupiny proteinů, prekurzorů pepsinů, aspartamových proteáz. Pepsinogen A je prekurzorem pepsinu A, pepsinogen C prekurzorem pepsinu C (gastricsinu). Elektroforeticky lze separovat 8 proteáz žaludeční sliznice, pepsinogeny PG1 - PG5 tvoří skupinu imunologicky identických proteinů - pepsinogen I (PG-I, PGA), pepsinogeny PG6 a PG7 tvoří skupinu pepsinogenu II (PG-II, PGC), posledním proteinem je Cathepsin E (SMP, Slow Moving Proteinase). Molekulová hmotnost pepsinogenu I je 42 500.
Metodika stanovení:
Gastroenterologická laboratoř používá soupravu pro ELISA techniku na mikrotitračních destičkách pro 96 vzorků ve stripovém uspořádání (8x12 vzorků). Specificita soupravy je determinována monoklonální protilátkou k lidskému pepsinogenu I, nekompetitivní sandwich-assay zahrnuje druhou anti-Ig protilátku značnou křenovou peroxidázou (HRP), substrátem chromogenní reakce je 3,3,5,5-tetramethylbenzidin (TMB).
Klinický význam stanovení sérové hladiny pepsinogenu I je především v dif.diagnostice žaludeční patologie a screeningu žaludečního karcinomu. Zvýšené riziko CA žaludku je popsáno u nemocných se zvýšenou hladinou IgA protilátek k Helicobacter pylori a sníženou hodnotou PG I.
Kromě pepsinogenu-I nabízíme i stanovení pepsinogenu-II a vypočtený poměr PGI/PGII.
Výhody stanovení PGI:
Referenční hodnoty v séru: 30 - 120 ug/l

Literatura:
Serum level of pepsinogen-I determined by ELISA method. Kocna P., Uhrová J., Švestka T., Vaníčková Z.:Biochemica Medica 2000, 10, 1-2, 104
Stanovení pepsinogenu-I v séru ELISA metodou. Kocna P., Uhrová J., Švestka T., Arnoštová L., Vaníčková Z. Česká a slovenská gastroenterologie, 1999, 53, Suppl.12, 92

Na doporučení České gastroenterologické společnosti a České pediatrické společnosti ustanovil ministr zdravotnictví Expertní skupinu pro celiakální sprue (ESCS). Tento krok se ukázal nezbytný pro neuspokojivý stav diagnostiky a léčení celiakální sprue, jakož i současnou sociální situaci řady nemocných s touto chorobou. Skupina vypracovala jako svůj první dokument Memorandum o současné problematice. Závěry tohoto dokumentu obsahují doporučení pro orgány exekutivy a zákonodárné sbory, aby ve spolupráci s ESCS byla zahájena jednání k řešení a zlepšení současné situace. ESCS považuje za vhodné text Memoranda publikovat, aby byla seznámena se současným stavem širší odborná i laická veřejnost a aby se ESCS mohla ucházet o jejich podporu.

Dokument byl zveřejněn na WWW MZCR, nyní je k dispozici na serveru 1LFUK - Memorandum - Celiakální sprue (cs) - současný stav a sociální situace nemocných v české republice
V květnu 2005 byla z Expertní skupiny ESCS sestavena Komise MZ ČR. Komise byla bohužel novým vedením ministerstva k 1.lednu 2006 zrušena.

Screeningový program céliakie zahrnuje dnes především stanovení protilátek IgA ke tkáňové transglutamináze - atTG, jako primární, základní test. Stanovení dalších protilátek - antigliadinových (AGA, AGG) a antiendomysiálních (EmA) nabízíme především v cílené diagnostice a dlohodobém sledování nemocných s céliakií. Protilátky antigliadinové a ke tkáňové transglutaminázeprotilátky stanovujeme také ve třídě IgG, vhodné pro screening osob s IgA deficitem, kdy AGA, atTG a EmA jsou negativní. Průkazem onemocnění stále zůstává histologie ze vzorku střevní sliznice.

Antigliadinové protilátky - AGA. Naše laboratoř nabízí rutinní stanovení antigliadinových protilátek třídy IgA a IgG metodou ELISA. Používáme ELISA soupravy, kde jako antigen je purifikovaný protein alpha-gliadin, pro zvýšení specificity testu. Alpha-gliadin je separován iontoměničovou chromatografií na SP-Sephadexu, metodika byla publikována v roce 1983.
Simple starch-gel electrophoresis of gliadin proteins using the LKB-Multiphor system. Kocna, P.; Holáková-Kočová, M.; Šašek, A.: Z.Lebens.Unters.Forsch., 1983, 177, 454-456.
Výsledek stanovení je vztažen na vnitrolaboratorní standard a je vyjádřen hodnotou indexu.
Referenční hodnoty AGA jsou pro IgA i IgG protilátky: index < 30.

Antiendomysiální protilátky - EmA. Detekci EmA protilátek provádíme immunofluorescenčním průkazem soupravou Biosystem s preparátem opičího jícnu.
Specificita a senzitivita EmA protilátek třídy IgA u aktivní céliakie je téměř 100%, po nasazení bezlepkové diety titr EmA protilátek klesá až k úplné negativitě testu. Negativní EmA IgA protilátky vykazují nemocní se selektivním IgA deficitem, toto onemocnění se vyskytuje u pacientů s céliakií cca ve 3%, což je 10-16x vyšší výskyt než v běžné populaci.

Anti-tissue transglutaminase protilátky - anti-tTG.
Detekci protilátek ke tkáňové transglutamináze provádíme od roku 1999, od ledna 2002 ELISA metodou s liským rekombinantním antigenem, který výrazně snižuje falešnou pozitivitu testů prováděných s morčecím antigenem. Klasická sandwichová ELISA s anti-IgA sekundární protilátkou značenou peroxidázou, substrát je TMB. Specificita uváděná výrobcem je 97.6%, senzitivita 100%.
Referenční hodnoty anti-tTG jsou pro IgA 0-10 U/ml, hodnoty > 10 U/ml jsou hodnoceny jako pozitivní, pro IgG jsou referenční meze 0-15 U/ml.

Podrobnější informace lze nalézt v textu, který byl uveřejněn v Bulletinu Ceterum č.11/1997 (pozn.kvalita obrázků v HTML dokumentu je redukována oproti verzi publikované na CD-ROM z důvodů objemu dat a rychlosti zobrazení.)

Literatura:
Kocna, P.: Celiakální sprue - gluten senzitivní enteropathie.Aktální diagnostika. Ceterum 1997, 11: 18-20
Kocna, P.: Glutenová enteropatie - nové diagnostické přístupy a screening. Klinická biochemie a metabolismus; 1997; 5: Supl., 20-23
Kocna, P.; Frič, P.; Tlaskalová-Hogenová, H.; Krchňák, V.; Kasafírek, E.; Šírová, M.: Gluten challenge effect on duodenal biopsy cultivation of coeliac patients and controls. Gastrointestinal Immunology and Gluten-Sensitive; 1994; 278-280
Kocna, P.; Frič, P.; Tlaskalová, H.; Krchňák, V.; Kasafírek, E.; Šírová, M.; Czerkinski, C.: Short-term cultivation of duodenal biopsies in patients with coeliac disease. Effect of the gluten challenge and gliadin peptides. Advances in Mucosal Immunology; 1995; 37: 2, 1367-1370
Kocna, P.; Vanickova, Z.; Perusicova, J.; Dvorak, M.: Tissue Transglutaminase - Serology Markers of Coeliac Disease Clin Chem Lab Med 2002; 40 (5): 485 – 492, on-line web free PDF Full text

Dechové testy jsou moderní, flexibilní variantou funkční diagnostiky v gastroenterologii. Funkční diagnostika v gastroenterologii je nyní v situaci, kdy na trhu není dostupný žádný nepřímý test pro diagnostiku exokrinní funkce pankreatu (ALTAB, PABA, Pankreolaury), není dostupný stimulační pentagastrin pro funkční testy žaludeční sekrece. Pro funkční diagnostiku tenkého střeva je velmi ojediněle používán zátěžový test s xylózou. Dechové testy se substráty značenými přirozeným izotopem uhlíku¹³C pokrývají kompletně potřeby funkčních testů v gastroenterologii.

Princip dechových testu s ¹³C-substrátem je založen na detekci relativního poměru ¹³C-CO₂ : ¹²C-CO₂ po perorálním podání značené substance., která je štěpena enzymem, jehož aktivita je mírou detekované funkce. Součástí každé soupravy je vlastní testační substance, např. ¹³C značená močovina, odběrové zkumavky typu Vacuette a trubičky, pro naplnění zkumavek. Hodnocení testu - stanovení přírustku ¹³C CO₂ je možné řadou analytických technik - nejjednodušší je IR fotomterie, dále např. diferenční laserová technika a velmi přesná je analýza hmotnostní spektrometrií s variantou pro stanovení poměru isotopů (IRMS - Isotope Ratio Mass Spectrometry).

Nejrozšířenější aplikací je průkaz infekce Helicobacter pylori ¹³C-ureou a to jak pro primární diagnostiku, tak pro ověření úspěšnosti eradikační léčby. Registrované soupravy pro detekci Helicobacter pylori UBT (Urea Breath Terst) v EU jsou: Pylobactell - Torbet Laborat.U.K., Helico-State - Simac Diag. Holland a Helicobacter Test INFAI - INFAI Germany. Další komerčně dostupné soupravy s ¹³C-substráty jsou dg.testy jaterních funkcí (¹³C-methacetin, ¹³C-aminopyrin), exokrinní funkce pankreatu (¹³C-mixed triglyceridy, ¹³C-hiolein, ¹³C-škrob), žaludeční motility (¹³C-octanoic acid) a bakteriálního přerůstání v tenkém střevu (¹³C-xylóza, ¹³C-glycocholic acid) a výrobci vlastních ¹³C-obohacovaných substancí - CIL - Cambridge Isotope Laboratories.

Analyzátory dechový testů - IRMS typu:
- Analyzátor GV2003 GV Instruments , původ systému je AP 2003 firmy Analytical Precision
- ABCA analyzátor SerCon Group , analyzátor Europa Scientific, později PDZ systems, nyní SerCon

Analyzátory dechový testů - NDIRS typu (IR):
- Isomax 4000 firmy Isodiagnostika Kanada
- HeliFAN Plus firmy Fischer Analysen Instr., systém FAN ci2 nabízel rovněž Olympus
- IRIS systém firmy Wagner, nyní Kibion - Švédsko
- UBiT-IR300 detektor Otsuka Electronics

Gastroenterologická laboratoř ÚKBLD VFN a 1.LFUK ve spolupráci s Gastroenterologickou ambulancí 4.interní kliniky provádí tři dechové testy zahrnující
- exokrinní funkci pankreatu, především pro posouzení chronické pankreatitidy a monitorování substituční terapie (substrátem je ¹³C-mixed triglycerid)
- diagnostiku bakteriálního přerůstání v tenkém střevě (substrátem je ¹³C-xylóza)
- diagnostiku Helicobacter pylori (substrátem je ¹³C-močovina).

Funkční testy jsou prováděny na základě indikací lékaře, gastroenterologa 4.interní kliniky, v rámci diferenciálně diagnostického programu. Vlastní provedení testu zahrnuje podání ¹³C-obohacené substance s následným odběrem několika vzorků vydechovaného vzduchu.
Podávané substance jsou ¹³C-močovina, ¹³C-xylóza a ¹³C-triglyceridy. Jedná se o zcela běžné složky potravy, které jsou obohaceny stabilním, přiozeným izotopem uhlíku 13C. Množství podávané substance je menší než 1% běžného denního příjmu. 100 mg močoviny podané pro dg.Helicobacter pylori představuje méně než 0.3% denního výdeje močoviny močí, které je cca 30g (500 mmol/24 hod). 250 mg podaného substrátu ¹³C-MTG představuje cca 0.25% denního přijmu triglyceridů, které tvoří cca 90% ze 100g denního příjmu tuků. Xylóza, monosacharid - pentóza je běžnou složkou přijímaných cukrů, denní příjem je cca 250g, pro rutinní D-xylózový test se podává 25g xylózy, pro dechový test pouze 100 mg ¹³C-xylózy. Stabilní izotop uhlíku ¹³C je přirozeným izotopem a tvoří cca 1.1% veškerého uhlíku v přírodě, tj. i uhlíku lidského těla. Zvýšení koncentrace vydechovaného izotopu ¹³C při provedení testu představuje změny v desetinách procenta, výsledky testů jsou vyjadřovány v hodnotách DOB (Delta Over Baseline) což je změna poměru ¹³C:¹²C v promilech (ppm).

Vzorky vzduchu pacient odebírá do jednoúčelových odběrových vaků s náustkem, chráněný obalem, který je odstraněn bezprostředně před použitím. Analytické vyhodnocení je prováděno IR analyzátorem HeliFAN.

Literatura:
Kocna, P.; Vaníčková, Z.; Krechler, T.; Lukáš, M.; Doseděl, J.: Test exokrinní funkce pankreatu - 13C-MTG dechový test. HPB Bulletin 2004, 12; 3: 76 - 77 - on-line verze: PDF Full text
Kocna, P.: Dechové testy - moderní, neinvazivní diagnostika. Interní medicína 2006; 8/7-8: 336 - 341 on-line verze v PDF: PDF Full text
Kocna, P.: Laboratorní diagnostika malabsorpčního syndromu. in Gastroenterologie 2006 - Collectio novissima, ed. Bureš J., Triton-Praha 2006, 181 - 198
Chleboun, J.; Kocna, P.: Isotope Selective Nondispersive Infrared Spectrometry Can Compete with Isotope Ratio Mass Spectrometry in Cumulative 13CO2 Breath Tests: Assessment of Accuracy. Klin. Biochem. Metab., 2005, 13; 34/2, 92 – 97 on-line verze v PDF: PDF Full text
Kocna, P.: Test helicobacter pylori ve vydechovaném vzduchu. MedicalMedia 2012: on-line video: www.medicalmedia.eu/detail.aspx?lang=cz&ID=155

Diagnostika Helicobacterové infekce
Bakterie Helicobacter pylori (dříve Campylobacter) je známa řadu desetiletí, její klinický význam však vzrostl teprve v roce 1982, kdy Warren a Marshal popsali přímý vztah k epithelu žaludeční sliznice u nemocných s gastritidou nebo žaludečními vředy. Pro diagnostiku infekce Helicobacterem pylori lze použít testů invasivních, vyžadujících odběr bioptického vzorku žaludeční nebo duodenální sliznice nebo testů neinvasivních. Kultivační test vykazuje nejvyšší sensitivitu i specificitu, nevýhodou je však značná citlivost bakterie Helicobacter pylori ke kyslíku, což vyžaduje specielní podmínky odběru a transportu. Rychlý ureázový (CLO) test je založen na intensivní aktivitě ureázy (povrchový marker bakterie Helicobacter pylori) a je rutinním průkazem při endoskopii. Novější testy stanovují v biopsii Helicobacter pylori imunologickým průkazem - metoda iRUT. Molekulární biologie a metody PCR umožňují další moderní metody detekce Helicobacter pylori, v biopsiích i ve vzorcích stolice.

Serologický průkaz protilátek k Helicobacter pylori v séru, ve slinách nebo ve vzorku moči patří k metodám neinvazivním, jde však o průkaz přítomnosti protilátek, nikoliv aktivní infekce Helicobacter pylori. Gastroenterologická laboratoř ÚKB LD stanovuje ELISA metodou protilátky IgG třídy.

Dechový test - 13C-UBT . Pro screening i primární, neinvazivní diagnostiku infekce Helicobacterem je doporučen, jako zlatý standard diagnostiky, dechový test založený na detekci ureázové aktivity - UBT (Urea Breath Test), kdy je stanovována změna poměru ¹³CO₂ : ¹²CO₂ ve vydechovaném vzduchu po rozštěpení perorálně podané močoviny značené stabilním izotopem uhlíku ¹³C, nebo detekce povrchových antigenů Helicobacter pylori ve vzorku stolice. Obě dvě uvedené metodiky jsou doporučeny také závěry Evropské pracovní skupiny - EHPSG (European Helicobacter Pylori Study Group) podle Maastrichtského konsenzu ze dne 21. a 22. září 2000 nejen pro primární diagnostiku, ale i k ověření úspěchu eradikační terapie.
Dechový test - UBT provádí Gastroenterologická laboratoř ÚKB LD soupravou INFAI schválenou a registrovanou v ČR - SÚKL. Stanovení poměru ¹³C-CO₂ : ¹²C-CO₂ ve vydechovaném vzduchu je prováděno metodou NDIRS - infračervené fotometrie na analyzátoru HeliFAN plus.

Průkaz Hp antigenu ve stolici. Detekci Helicobacter specifického antigenu ve stolici provádíme v Gastroenterologická laboratoř ÚKB LD ELISA soupravou HpStAR (Oxoid - DAKO) analýzou 100 mg vzorku stolice. Test je vyhodnocen semikvantitativně.